一、大豆子叶节再生及农杆菌介导转化研究（论文文献综述）
周玉梅[1]（2020）在《苦豆子遗传转化体系的建立和盐胁迫下SaLDC表达分析》文中认为赖氨酸脱羧酶基因（SaLDC）是苦豆子中氧化苦参碱和苦参碱生物合成的第一个关键酶基因,在其生物代谢过程中具有重要意义。本研究以宁夏中药材苦豆子为材料,对实验室已有子叶节再生体系进一步优化,并以此优化的再生体系为基础,将构建的SaLDC超表达载体以传统方法和原位转化方法分别遗传转化苦豆子子叶节,获得T0代转基因植株,为SaLDC基因功能研究奠定基础。用NaCl溶液模拟盐环境胁迫苦豆子种子,分析种子萌发时的耐盐阈值和耐盐相关的生理特性、SaLDC的基因表达及与该基因直接产物尸胺（Cad）含量的关系;同时花序侵染法将SaLDC超表达载体遗传转化拟南芥,用NaCl溶液胁迫转基因拟南芥T2代株系,探讨SaLDC对盐胁迫的响应。得到以下研究结果:（1）苦豆子愈伤组织诱导的最佳外植体是子叶节,优化后的苦豆子子叶节再生体系,最佳丛生芽诱导培养基为:MS+1.25 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;最佳丛生芽增殖培养基为:MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 IBA。（2）构建超表达载体pCAMBIA3301-SaLDC,将预培养2d的苦豆子子叶节外植体在含有超表达载体的农杆菌（菌液浓度OD600=0.5）侵染液中（含200 μmol·L-1AS）侵染15 min,农杆菌与外植体共培养 1 d,并在 MS+1.25 mg.L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+500 mg·L-1Cef 培养基上除菌6次,丛生芽率可达到20.83%,PCR鉴定T0代阳性率为55.56%,是一个比较理想的遗传转化体系。（3）对土培7d的苦豆子幼苗,在自然生长状态下对子叶节部位产生伤口,用含有超表达载体pCAMBIA3301-SaLDC的农杆菌（菌液浓度OD600=0.8）侵染液侵染15min,侵染液与子叶节部位黑暗共培养3d,用蘸有3.34 mg·L-1 6-BA水溶液的脱脂棉球置于子叶节部位,保湿条件下光照诱导10 d,植株再生芽率高达86.67%。T0代转基因枝条草铵膦抗性筛选率为56.67%,PCR阳性率为50.82%,该方法操作简单,并且可以获得较高的苦豆子遗传转化效率。（4）盐胁迫影响苦豆子种子的萌发和相关耐盐生理特性,随NaCl溶液浓度增加,种子的各项活力指标降低,相对盐害率上升,种子在萌发过程中能耐受NaCl溶液胁迫并保持正常萌发率达到50%的阈值为200 mmol.L-1。轻度盐胁迫（≤100 mmol.L-1）时,POD酶起主要保护作用,在重度盐胁迫（>200 mmol·L-1）下,CAT酶起主要保护作用。SaLDC在子叶中表达量最高,其次是胚根,下胚轴中表达量最低,存在明显的组织特异性,且盐胁迫促使该基因在各组织中均表达上调;子叶中未检测到Cad,但在下胚轴和胚根中随NaCl溶液浓度的增加Cad含量降低,各组织中SaLDC表达量与Cad含量相关性不显着。（5）利用花序侵染法将SaLDC遗传转化拟南芥,用草铵膦和PCR鉴定、筛选出转基因拟南芥阳性苗,用NaCl溶液胁迫正常萌发的T2代种子7d,与野生型拟南芥相比,转基因株系的相对根长和侧根数增加。sa2株系转基因拟南芥株系SaLDC相对表达量最高,对该株系用200 mmol·L-1NaCl溶液胁迫7 d,SaLDC表达量极显着下降。
孙英楠[2]（2020）在《种子特异表达SiDGAT1转基因大豆新种质的创制》文中研究说明大豆是世界上主要的油料作物,大豆油的需求量在食用植物油中占首位。我国是大豆油消费大国,但由于我国大豆单产低、种子含油量低,不能满足日益增长的需求,很大程度上依赖于进口大豆。因此,培育高油大豆新品种是解决大豆油需求量不足问题的有效途径之一。传统育种方法效率低、周期长,而且受种质资源限制。随着科学技术的发展,转基因技术逐渐兴起,该技术可以靠改变植物遗传物质获得目标性状。转基因技术与传统育种方法相结合,可以有效促进作物育种技术的发展。二酰基甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase简称为DGAT）是三酰甘油（Triacylglycerol,简称为TAG）合成过程中的限速酶,它对控制植物种子中三酰基甘油合成的末端步骤起关键作用。Si DGAT1基因编码芝麻二酰甘油酰基转移酶,c DNA全长1623bp。本团队前期研究证明,在拟南芥和大豆中利用Ca MV35S组成型启动子驱动该基因表达,过表达植株种子油分含量被显着提高。种子特异性启动子可使目的基因在植物种子中进行特异性表达,以此来避免目的基因在转基因植株中各个器官过量表达造成的能量浪费以及可能对植物生长发育带来的不利影响。因此,本研究通过构建PBA002-P8-Si DGAT1植物种子特异性表达载体,利用农杆菌介导大豆子叶节遗传转化法,将Si DGAT1基因分别转入受体东农50和垦农18两个大豆栽培品种中,使Si DGAT1基因在转基因大豆植株种子中特异性表达,获得高油转基因阳性植株,为高油转基因大豆育种提供新材料。具体研究结果如下:（1）构建了植物种子特异性表达载体PBA002-P8-Si DGAT1。（2）利用农杆菌介导大豆子叶节遗传转化法,将Si DGAT1基因转化到大豆栽培品种东农50和垦农18中,共获得T0代转基因大豆植株12株。其中,以东农50为受体的转基因阳性植株4株,以垦农18为受体的转基因阳性植株8株。（3）利用130mg/L草铵膦抗性鉴定、PCR扩增、Western blot等检测方法筛选获得4个可遗传的T1代转基因大豆株系K18-4-1、K18-5-1、K18-6-1、D50-7-1,证明目的基因Si DGAT1已经整合到受体大豆基因组中,并且可以遗传。利用q RT-PCR方法对T2代转基因株系中目的基因Si DGAT1在转基因大豆不同组织器官中的表达量进行检测,结果证明,Si DGAT1在转基因种子中表达量最高。（4）利用近红外谷物分析仪测定T1代转基因大豆株系K18-4-1、K18-5-1、K18-6-1和对照品种垦农18的种子含油量,结果表明,转基因大豆株系和对照相比种子油分含量升高。而且,还发现过表达Si DGAT1基因可对转基因大豆子粒大小产生影响。
赵强[3]（2020）在《外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究》文中进行了进一步梳理转基因技术具有推动农业生产发生革命性变化的潜力。农杆菌介导的遗传转化法是目前应用最为广泛的大豆遗传转化方法。但是,与其他的物种相比较,低转化效率一直是大豆基因功能研究中的一个瓶颈,制约了转基因大豆的商业化发展。并且,大豆的遗传转化效率具有很强的基因型依赖性,这限制了遗传转化技术在具有良好性状的商业化大豆品种中的应用。本研究采用不同大豆品种进行农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化和大豆原生质体细胞转化试验,分析了不同大豆品种转化早期阶段外源基因表达差异及其调控机制对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响,以期提高大豆的抗性丛生芽再生效率,得到以下主要结果:（1）筛选得到高/低遗传转化效率大豆品种。利用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系对17个大豆品种进行遗传转化试验,共获得168株转基因大豆植株。根据不同大豆品种的遗传转化效率,筛选得到大豆品种东农50（DN50）,Williams 82（Wm82）,Bert（Br）和沈农9（SN9）为高遗传转化效率大豆品种（转化效率高于5.5%）,而Kottman（Kt）,General（Gr）,中黄35（ZH35）和辽豆16（LD16）为低遗传转化效率大豆品种（转化效率低于1%）。在农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化试验中,当培养基中含有筛选剂(5mg·L-1草铵膦)时,高遗传转化效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率达到75%以上,而低遗传效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率低于20%。并且,不同大豆品种的芽伸长效率（约80%）和生根效率（约85%）没有显着的差异。（2）建立并优化大豆原生质体细胞分离、纯化和转化表达体系。以28℃黑暗环境下培养至真叶完全展开后4天的大豆叶片为材料;使用含有0.4M甘露醇的CPW溶液对组织材料进行预处理30min;使用含有1.6%纤维素酶,0.8%离析酶和1.5%的果胶酶的酶解液于黑暗条件下130r/min×28℃振荡酶解10小时;采用300目细胞筛与100g离心的方法纯化大豆原生质体细胞,得到的大豆原生质体细胞的产量约为1.12×107个·g·FW-1,原生质体细胞活力均达到92%以上;使用20%PEG4000介导法将植物表达载体pEarleyGate 104和pER8-GFP分别转化进入大豆原生质体细胞,以EYFP/GFP作为荧光报告蛋白,在转化后第2天（2DAT）观察到不同大豆品种转化效率（荧光细胞占比）均达到75%以上。（3）高/低遗传转化效率大豆品种原生质体细胞的外源基因表达存在显着差异。在大豆原生质体细胞中,外源基因的转化效率随着培养时间内的延长呈现先上升后下降的趋势,在2DAT时达到最大值,且在1-2DAT时,不同大豆品种原生质中外源基因的转化效率之间没有显着的差异;而在3DAT时,低遗传转化效率大豆品种的外源基因转化效率和基因表达水平显着的低于高遗传转化大豆品种。（4）内源蛋白酶水解途径不是造成大豆原生质体中外源基因表达水平降低的主要原因。与对照相比较,向原生质体细胞培养液中分别添加外源蛋白酶抑制剂MG132（20μM）、AEBSF（50μM）和MG115（200μM）对于3DAT时外源基因的转化效率和基因表达水平没有显着的影响。（5）甲基化抑制剂5-Azac显着的影响外源基因的表达水平。与2DAT相比较,3DAT时,低遗传转化效率大豆品种甲基化酶编码基因MET1的表达水平显着上升,且显着高于高遗传转化效率大豆品种。同时,低遗传转化效率大豆品种外源基因EYFP的启动子区和编码区的甲基化水平显着的显着高于高遗传转化效率大豆品种。10μM的甲基化抑制剂5-Azac处理能够显着的降低低遗传转化效率大豆品种中外源基因的启动子及编码区的DNA甲基化程度,并提高外源基因的表达水平。（6）甲基化抑制剂显着的增加了低遗传转化效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率。在农杆菌介导的大豆遗传转化体系中,在抗性丛生芽诱导1周后,向培养基中加入10μM的甲基化抑制剂5-Azac能够显着的提高大部分大豆品种（19/22）的抗性丛生芽的筛选效率,特别是对于低遗传转化效率大豆品种的促进效果更为显着。综上所述,在本研究中低遗传效率大豆品种中外源基因启动子及编码区较高程度的DNA甲基化水平,抑制了外源基因的表达,并导致了抗性丛生芽诱导效率的低下。甲基化抑制剂5-Azac能够有效的降低外源基因的DNA甲基化程度,并提高低遗传转化效率抗性丛生芽的诱导效率。由于抗性丛生芽的再生是农杆菌介导的大豆遗传转化中的关键步骤,这些结果为提高低遗传转化效率大豆基因型的遗传转化效率提供了新的途径,有利于克服大豆遗传转化困难的问题。
王立平,何展泳,年海,王宏杰,马启彬[4]（2020）在《大豆遗传转化方法及再生体系研究进展》文中研究指明转基因技术作为现代生物技术之一,在基因功能研究和转基因育种方面取得重要进展。大豆基因组测序之后,大豆功能基因组学发展迅速,挖掘控制重要性状的基因用于转基因育种受到广泛关注。随着转基因大豆新品种培育重大专项的实施,我国建立了基因克隆、遗传转化、功能研究、转基因品系安全评价等转基因育种研究技术体系和监管体系。其中,转基因大豆遗传转化技术体系的研究取得了较快的进展,主要集中在高效、稳定遗传转化再生体系的建立和优化,大豆遗传转化方法的探索和优化等方面。对大豆遗传转化体系、转化方法和转化效率等因素进行阐述,可为大豆基因功能研究和转基因新品种培育相关研究提供参考。
杨柳[5]（2019）在《HN-ZMZ-1基因克隆及农杆菌转化研究》文中研究说明大豆是我国主要的粮食作物之一,也是日常生活所需的蛋白质和植物油的主要来源。利用基因工程技术培育高产、优质的大豆品种可以在一定程度上缓解我国对大豆进口的依赖性,对满足人们日益增长的产量和品质要求意义重大。光合作用是产量形成的关键因素,景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶（SBPase）是光合卡尔文循环中控制碳流通的关键酶,还关系到Ru BP的再生及碳水化合物的合成。本研究首先以大豆品种沈农9和Williams82为试验材料,对农杆菌介导的大豆遗传转化体系进行了优化,以期提高抗性丛生芽诱导率。然后利用优化的农杆菌转化体系转化克隆的大豆SBPase基因,并将该基因命名为HN-ZMZ-1,最后对T0代阳性植株初步验证。本研究将为建立高效、稳定的大豆转化体系提供基础,及HN-ZMZ-1基因功能的深入研究、高产大豆育种实践提供理论基础。主要研究结果如下:1.采用大豆子叶节划伤与不划伤两种处理研究对抗性丛生芽诱导的影响,结果表明划伤子叶节比不划伤子叶节能获得更高的抗性丛生芽诱导率,两者差异显着。农杆菌侵染外植体过程中,采用0.5 MP的真空渗透3 min能够提高大豆抗性丛生芽诱导率。共培养过程先暗培养3天,再光照培养2天有利于抗性丛生芽的诱导。6-BA浓度为1.75 mg′L-1时,大豆抗性丛生芽诱导率达到最高。2.本研究从大豆基因型Williams 82叶片中克隆SBPase基因,命名为HN-ZMZ-1。序列分析表明,该基因全长为1,399 bp,有一个1,164 bp的编码框,共编码387个氨基酸,分子式为C1864H2951N489O573S11,蛋白质分子量为41.7k Da,等电点为6.05,属于磷酸酶家族成员,与菜豆属、豇豆属亲缘关系较近。同时构建了HN-ZMZ-1基因的植物表达载体pEarleyGate100-HN-ZMZ-1,含有筛选标记Bar基因和Kan,并转入根癌农杆菌菌株GV3101中,用于后续大豆遗传转化。3.使用含有表达载体pEarleyGate100-HN-ZMZ-1的农杆菌菌株GV3101转化Williams 82,经过抗性丛生芽诱导、伸长、生根、炼苗和移栽等步骤,获得移栽成活的抗性植株52株。通过PCR检测共获得6株T0代阳性植株,包括转HN-ZMZ-1基因4株（Tr）,转空载体2株（Tr-CK）。对转HN-ZMZ-1基因植株进行荧光定量PCR分析,结果表明转基因植株HN-ZMZ-1基因转录表达量显着高于对照,分别为对照的1.58倍、3.29倍、3.9倍和3.22倍。
王蕊[6]（2018）在《农杆菌介导的大豆不同外植体转化效率研究》文中进行了进一步梳理本试验以20种东北地区主栽品种为试验材料,分别建立大豆子叶节转化再生体系和大豆愈伤组织的遗传转化体系,对这些大豆品种的丛生芽再生率、抗性丛生芽率、子叶节GUS染色率,愈伤组织GUS染色率等指标进行比较和研究,旨在筛选出适合用于大豆遗传转化试验的最有效的大豆品种,为东北地区大豆实验室建立优良的大豆转化体系和大豆再生体系,提供品种选择上的理论依据和数据支持。主要研究结果如下:1.铁丰31、沈农20、辽豆13、辽豆32、东豆17、黑农59、黑农60、南农31,以上8个品种在两种外植体的农杆菌介导转化试验中均表现出较高转化效率。2.中黄35、沈农8、辽豆50、东豆641、黑农54、铁豆81,以上6个品种,在两种外植体的农杆菌介导转化试验中表现为低转化效率。3.对比了不同品种的转化效率表现,发现中黄13、辽豆15、东豆9、铁豆37、中黄56、沈农22,这6个品种的转化效率情况与其在试验中所选择的外植体类型有关。4.中黄56、沈农22这两个品种,因其产生了嵌合体而呈现假阳性,导致在子叶节中体现出较低的转化率,而在愈伤组织的农杆菌介导试验中表现出高转化效率;中黄13、辽豆15、东豆9、铁豆37,这4个品种,在子叶节的农杆菌介导试验中体现了高转化效率,但在愈伤组织的农杆菌介导试验中转化效率较低。这一筛选结果可以做为给后续选择适合于不同外植体转化再生试验的大豆品种选择提供建议与指导的理论依据。
李姝璇[7]（2018）在《农杆菌介导的大豆遗传转化方法优化及KN1和GID1基因对大豆再生和遗传转化效率的影响》文中研究表明近年来我国大豆进口量日益增加,而进口大豆多为转基因品种,在产量和价格上比国产大豆具有一定优势。因此,我国亟待开展大豆转基因技术研究,希望通过生物技术直接向大豆中导入一些优良性状基因,以提高产量、改良品质、获得抗病虫、抗除草剂等抗性,提高我国大豆的生产能力和国际竞争能力,缓解大豆市场的供需矛盾。高效遗传转化体系是进行基因功能研究和分子育种的先决条件。农杆菌介导的遗传转化方法是许多植物转化的优选方法。但是,相对于水稻、小麦等作物,大豆转化效率仍然较低。因此,如何提高大豆的遗传转化效率是目前亟待解决的问题。本研究通过对影响农杆菌侵染效率和大豆再生效率的因素进行优化,以提高大豆遗传转化效率;并通过构建含植物激素相关基因的表达载体探索了 ZmKN1（玉米Knotted 1基因）和GmGID1s（大豆GA Insensitive Dwarf1基因）对大豆再生和遗传转化效率及植株表型的影响。本研究获得的主要结果如下:1.通过提高农杆菌的侵染效率（侵染时菌液的浓度、重悬液成分、获取外植体方式、共培养时间、大豆品种等）和大豆外植体再生效率来优化农杆菌介导的大豆转化效率。本试验所用载体为pTF102,农杆菌菌株为EHA101。结果表明在农杆菌生长至浓度为OD650=0.6收菌,并在重悬液中添加154.2 mg/L的DTT（Dithiothreitol）侵染用浸泡过夜方式获取的外植体（大豆品种为Jack Purple和天隆1号）,共培养5天后外植体的侵染效率达到96%以上。另一方面,比较在芽伸长培养基中使用不同浓度组合的赤霉素 GA3（Gibberellin）和生长素 IAA（Indole-3-acetic acid）,发现使用 1.0 mg/L GA3和0.1 mg/L IAA的浓度组合时,Jack Purple和天隆1号这两个品种的伸长效率分别为34%和26%,比其他5组的高,比使用原始培养基（浓度组合为0.5 mg/L GA3和0.1 mg/L IAA）的伸长效率分别增加了 18%和11%。在这个优化后的激素浓度组合下,Jack Purple和天隆1号这两个品种的转化效率分别为7%和10%,与原始培养基相比分别增加了 2%和6%。2.细胞分裂素是重要的植物激素之一,能够促进植物细胞的分裂及增殖、诱导芽分化、解除顶端优势。其中KN1基因在拟南芥、烟草、水稻等植物中均可促进植物体内细胞分裂素含量增加,诱导不定芽生成,提高转化效率,因此本研究希望探索KN1基因是否能提高大豆再生和转化效率。首先构建pCAMBIA3301-35S-ZmKN1-NOS载体,然后转入农杆菌EHA105并进行大豆转化。结果发现ZmKN1基因可能促进大豆丛生芽伸长,但假阳性（非转基因）的丛生芽也得以伸长。获得过表达ZmKN1基因的大豆阳性植株并观察其后代表型,发现与正常植株相比,过表达ZmKN1基因的大豆植株叶片发生卷曲,叶柄发生旋转;叶脉出现不规则凸起;叶柄与主茎夹角近乎平行;开花提前;植株较小;平均每荚粒数（少于2粒）显着少于对照受体植株的平均每荚粒数（大于2粒）。以上结果表明过表达KN1基因可能促进大豆丛生芽伸长率,但存在假阳性高、影响其他表型性状等问题,尚需通过构建诱导性启动子调控KN1基因的表达。3.在上述1中的研究表明,培养基中外源GA的浓度影响大豆的伸长率和转化效率。因此,我们希望通过构建含与GA相关基因的载体转化大豆,以期通过在组织培养过程中增加外植体对GA的敏感性来提高丛生芽伸长率,从而提高转化效率。GA受体蛋白GID1能够直接与GA结合,并和抑制植株生长的DELLA相关蛋白产生三联复合体,通过SCF识别后被E3泛素化,将DELLA降解,从而解除对植株生长的抑制,促进植株的生长。通过BLAST检索,发现大豆中有5条与拟南芥AtGID1同源的基因,其编码蛋白具有与活性GA结合、感知GA信号的保守结构域HGG和GDSSGG,根据染色体位置分别命名为GmGID1-1～GmGID1-5。GmGID1s基因的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为 1029～1041 bp,氨基酸数目为 342～346,分子质量为38.67～39.39 KDa。用100 mg/L的GA喷施叶片后取叶片和茎进行荧光定量,结果表明GmGID1s基因的表达受外源GA的诱导上调,且在GA处理12 h时,大豆叶片中的GmGID1s表达量除GmGID1-1基因外比0 h对照都显着增高,大豆茎中的GmGID1s表达量除GmGID1-3基因外都显着增高（P<0.05）。4.构建pCAMBIA3301-35S-GID1s-NOS等分别含GmGID1-1～GmGID1-5基因的5个载体,转入农杆菌EHA105并进行大豆转化。转GmGID1-1、GmGID1-2基因的大豆丛生芽伸长效率分别为36.13%、30.84%,高于其他三个基因;转GmGID1-2基因所获得的转化效率最高,达到6.68%,其次是GmGID1-3,为3.77%。通过比较5个GmGID1s基因对大豆再生和转化效率的影响,发现GmGID1-2基因在促进大豆丛生芽伸长方面具有一定作用,但实验尚需多次重复以验证该结论。此外,过表达GmGID1-2基因的大豆后代植株平均高度为109.6 cm,显着（P<0.05,t检验）高于对照的平均株高20.5 cm,后期尚需观察过表达GmGID1-2基因对大豆其他农艺性状的影响。
曾旋睿[8]（2017）在《大豆品质改良相关基因GmAGL1,GmDof11和GmDof4的遗传转化研究》文中研究表明大豆（Glycine max（L.）Merri.）既是重要的粮食和经济作物,又是油料和饲料的重要来源。随着大豆需求量逐年增大,我国大豆消费越来越多的依赖进口,这对我国农业生产和国家粮食安全构成了潜在的威胁。因此,研究大豆增产和品质改良相关机理,自主培育高产优质的大豆新种质,提升我国大豆产业国际竞争力,是大豆产业相关研究人员的重要目标。转基因技术作为一种有效的种质创新和品种改良方法,已经应用在许多作物中,并得到了 一些优良品种。目前大豆转基因方法以根瘤农杆菌介导法和基因枪法为主,经过多年的改良,这两个体系已经趋向成熟。通过转基因可以对大豆种子成分如蛋白质和氨基酸组成、油脂含量和构成,以及异黄酮、大豆皂苷、肌醇等生理活性成分进行改良,还可以增强大豆的生物和非生物胁迫抗性。目标基因的选择是大豆转基因工作中的重要部分。转录因子（transcription factor）是一组通过调节下游靶基因的表达调控细胞进程的基因。它们能够与目的基因发生特异性结合并对转录有激活或抑制作用,对转录调控网络的构建至关重要。MADS-box基因家族和Dof基因家族都是大豆中重要的转录因子家族,参与调控植物生长发育的许多生理生化进程。MADS-box转录因子在植物生长和发育,特别是生殖器官的发育中起着重要的作用。大豆的生殖生长与产量密切相关,MADS-box基因很有可能对大豆种子产量和种子成分具有重要影响。Dof转录因子参与光响应和与光周期相关的开花调控、花器官发育、种子发育、植物储藏物质合成以及次生代谢物合成及防御反应等多种生物学过程,也与种子的生长发育密切相关。因此,我们在这两个基因家族中选择了几个基因进行遗传转化研究,主要研究结果如下:（1）基因型的限制是大豆转化率低下的重要原因,因此选择合适的大豆基因型作为受体,是提高转化效率的关键。本研究首先利用GUS基因在植物体中瞬时表达的特点,对约40个不同基因型大豆种质材料的农杆菌敏感性进行了比较,再结合大豆种子的发芽率、不定芽再生效率、增殖系数以及对不同大豆基因型对筛选剂的敏感性等因素,筛选适宜的受体基因型。在此基础上,以带有MADS-box家族基因GmSEP3的pMDC83-GmSEP3为载体,用筛选出的大豆基因型作为受体材料进行遗传转化试验以验证筛选结果。研究结果表明,不同基因型的大豆材料对根瘤农杆菌的敏感性差异较大。在本研究涉及的品种中,对农杆菌较敏感（GUS瞬时表达较高）且再生、增殖效率较高的品种有:猴子毛、88-1、Jack、Williams、大粒黄。在不同的筛选条件下,不同基因型的材料敏感性存在较大差异,在实际实验操作中,应根据筛选剂来选择适合的受体。本实验中筛选得到的五个大豆基因型都可以成功转入pMDC83-GmSEP3,为日后的遗传转化研究提供了更多受体选择。（2）将从大豆花中分离出的MADS-box基因GmAGL1转入大豆中进行功能研究,结果发现GmAGL1表达量高的转基因植株不仅提前开花和成熟,并且花瓣发育也受到影响。在长日照条件下,GmAGL1过表达植株比短日照条件下提前开花的现象更为显着。转录组分析发现光受体基因CRY2和部分昼夜节律基因下调表达,以及开花促进基因LHY、GI和花发育相关基因LFY、SEP1、SEP3、AP1、FUL上调表达,共同促进了转基因大豆开花。而其他开花调节途径:春化途径、GA途径和自主途径的相关基因表达差异都比较小。这些结果表明GmAGL1过表达对开花的促进作用主要通过光周期途径完成。过表达GmAGL1转基因植株提前开花、生育期缩短,但转基因大豆的产量和油脂、蛋白含量并没有减少,这对生产轮作具有积极意义。（3）以GmCAX1作为选择标记基因进行大豆遗传转化。GmCAX1基因可以编码一种阳离子/质子反向运输体,有利于调节离子平衡,从而降低植物对离子的敏感程度,经验证具有耐Li+作用,有希望作为一种新型的标记基因来使用。我们以GmCAX1为抗性标记将Dof转录因子GmDof11转化大豆,获得了耐LiCl的转基因植株,并建立了一种通过水培处理筛选和鉴定转基因后代的方法。经水培筛选得到的存活转基因植株经转基因检测全部为阳性。过表达GmDof11提高了大豆种子油脂的含量,蛋白质含量没有降低,暗示GmDof11可能在大豆种子储藏物质的形成方面发挥作用。（4）通过在大豆品种Jack和猴子毛中过表达Dof转录因子GmDof4,得到多个阳性植株。对GmDof4表达量高的转基因植株进行表型分析发现,在两个受体品种中,过表达GmDof4基因都可以显着增加分枝数、分枝长度,并因此提高了结荚数、种子数和单株产量。对转基因种子的油脂和蛋白含量进行分析发现,与野生型受体相比,转基因大豆种子中的油脂含量显着提高,储藏蛋白含量下降。在大豆中过表达GmDof4提高大豆产量和种子油脂含量,在生产上具有重要意义,也为我们深入研究GmDof4基因在大豆中的功能提供了实验材料和研究方向。
王伟,姚嘉龙,熊鹤雯,吴志慧,王程,郭蓓,谢皓[9]（2015）在《大豆科丰14子叶节遗传转化体系的优化》文中提出科丰14是一个适应性较广的大粒型大豆品种,以农杆菌介导的子叶节法为转化途径,研究农杆菌侵染时间、6-BA浓度及培养基中添加硫代硫酸钠对转化率的影响,以建立适宜科丰14的子叶节遗传转化体系。结果表明:当农杆菌侵染外植体时间为15 min、丛生芽培养基中6-BA的浓度为1.50 mg·L-1时产生的丛生芽率最高,可达72.92%;在共培养基中加入1 mmol·L-1的硫代硫酸钠能有效防止外植体褐化,提高丛生芽率;利用GUS基因染色技术检测转化效果,表明在大豆常规转化体系的基础上,上述措施可提高科丰14的转化效率。
靳京[10]（2015）在《利用Lyr基因建立大豆安全筛选标记体系的研究》文中认为大豆（Glycine max）作为全球重要的油料作物,对全世界的社会效益与经济效益有着至关重要的作用,因此,对其产量的需求越来越大。科研工作者们通过利用转基因技术培育出抗虫、抗旱、高产等新品系转基因大豆,以满足社会对大豆产量的需求。然而,在转基因食品带来更好效益的同时,转基因植株中基于抗生素和除草剂的筛选标记基因的使用越来越引起人们对生态安全以及食品安全问题的担忧。由此,无选择标记转基因植物的培育显得尤为重要。赖氨酸消旋酶（Lysine racemase,Lyr）存在于土壤微生物中,它催化L-型赖氨酸（L-Lys）和D-型赖氨酸（D-L-Lys）之间的相互转化,野生型植物细胞对L-Lys敏感,但D-Lys却促进了它们的生长,转入Lyr基因的植株可在含有L-Lys与琼脂的培养基上正常生长,未转化植株则生长受到抑制。本研究利用Lyr基因建立大豆安全筛选标记体系,构建Lyr基因与Bar基因并存的双基因标记植物表达载体pBasta-Lyr,利用农杆菌介导法转化大豆子叶节,并且以赖氨酸、Basta为筛选标记,确定在生芽培养基中赖氨酸的筛选压,进一步比较两种标记下转基因大豆在适当筛选压下筛选效率、生长状态以及转化率,为应用Lyr基因作为安全选择标记基因提供可靠理论依据。研究结果如下:1、合成Lyr基因并重组到pBasta质粒中,具有L-型赖氨酸（L-Lysine,L-Lys）和Basta作为筛选标记的双标记植物表达载体pBasta-Lyr,并将该质粒转入农杆菌EHA105菌株中用于大豆转化。2、通过多次重复,统计生芽培养基（SI）中不同L-Lys浓度下大豆子叶节的芽再生率,确定了两个品种的大豆（吉育72、威廉姆斯82）在SI培养基中L-Lys的筛选压。结果表明两种大豆品种子叶节几乎全部死亡的赖氨酸筛选压分别是吉育72:16mM;威廉姆斯82:22mM。3、利用含有pBasta-Lyr质粒的农杆菌,通过农杆菌介导法侵染转化大豆（吉育72、威廉姆斯82）,并分别以L-Lys和Basta为选择剂筛选转化植株。结果表明,大豆品种相同,以L-Lys为筛选剂比Basta为筛选剂抗性芽再生率高4%;在SE培养基中,利用L-Lys筛选的抗性苗较用Basta筛选的抗性苗生长旺盛,根系较发达,株茎较粗壮。4、通过PCR技术鉴定T0代、T1代转化植株获得相应的转化率。T0代吉育72:L-Lys筛选植株转化率4.33%,Basta筛选植株转化率3.17%;威廉姆斯82:L-Lys筛选植株转化率5.33%,Basta筛选植株转化率0.83%。T1代吉育72:L-Lys筛选植株转化率1.50%,Basta筛选植株转化率0.67%;威廉姆斯82:L-Lys筛选植株转化率1.50%,Basta筛选植株转化率0.17%。对部分T2代转化植株进行PCR及Southern blot杂交检测进一步比较两筛选体系差异。证明L-Lys筛选标记体系优于Basta筛选标记体系,为大豆转基因技术中有关选择标记安全问题提供借鉴。
二、大豆子叶节再生及农杆菌介导转化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大豆子叶节再生及农杆菌介导转化研究（论文提纲范文）
（1）苦豆子遗传转化体系的建立和盐胁迫下SaLDC表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物基因功能验证研究进展 |
| 1.1.1 植物遗传转化概述 |
| 1.1.2 农杆菌介导的传统遗传转化 |
| 1.1.3 农杆菌介导的原位遗传转化研究 |
| 1.1.4 基因超表达技术 |
| 1.2 赖氨酸脱羧酶基因研究进展 |
| 1.2.1 赖氨酸脱羧酶的研究 |
| 1.2.2 赖氨酸脱羧酶基因的研究 |
| 1.2.3 尸胺的研究 |
| 1.3 苦豆子研究概述 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 苦豆子遗传转化体系的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂及其配制 |
| 2.2.3 菌株和质粒 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 苦豆子无菌苗获得 |
| 2.3.2 苦豆子子叶节丛生芽诱导和增殖培养 |
| 2.3.3 SaLDC超表达载体的构建 |
| 2.4 农杆菌介导的苦豆子子叶节传统遗传转化 |
| 2.4.1 苦豆子子叶节外植体的获得 |
| 2.4.2 农杆菌活化与培养 |
| 2.4.3 农杆菌介导遗传转化苦豆子子叶节外植体 |
| 2.4.4 转基因苦豆子丛生芽PCR分子鉴定 |
| 2.5 农杆菌介导的苦豆子子叶节原位遗传转化 |
| 2.5.1 苦豆子种子萌发 |
| 2.5.2 农杆菌介导的苦豆子子叶节原位遗传转化 |
| 2.5.3 转化芽诱导和植株再生 |
| 2.5.4 抗草铵膦的转基因苦豆子植株筛选 |
| 2.5.5 T_0代转基因植株的PCR检测 |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 2.7 结果与分析 |
| 2.7.1 苦豆子子叶节再生体系的优化 |
| 2.7.2 SaLDC超表达载体的构建、鉴定和转化农杆菌 |
| 2.7.3 苦豆子传统遗传转化体系建立 |
| 2.7.4 苦豆子原位遗传转化体系建立 |
| 2.8 讨论 |
| 2.8.1 苦豆子子叶节再生体系的优化 |
| 2.8.2 农杆菌介导的苦豆子子叶节传统遗传转化体系的建立 |
| 2.8.3 农杆菌介导的苦豆子子叶节原位遗传转化体系的建立 |
| 第三章 基于盐胁迫的苦豆子种子生理特性和赖氨酸脱羧酶基因表达分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 苦豆子种子的萌发 |
| 3.3.2 萌发种子子叶生理生化指标的测定 |
| 3.3.3 尸胺提取和含量测定 |
| 3.3.4 总RNA提取cDNA第一链合成 |
| 3.3.5 荧光定量PCR |
| 3.4 数据处理 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 NaCl胁迫对苦豆子种子萌发的影响 |
| 3.5.2 NaCl胁迫对苦豆子种子抗逆生理特性的影响 |
| 3.5.3 苦豆子种子萌发过程中赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC)对NaCl胁迫的响应 |
| 3.5.4 NaCl胁迫后苦豆子萌发种子中尸胺含量的变化 |
| 3.5.5 NaCl胁迫后SaLDC表达量、种子抗逆生理指标和Cad含量的相关关系 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 SaLDC在拟南芥中异源超量表达分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 仪器与试剂 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 菌株与质粒 |
| 4.2.3 试剂及其配制 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 农杆菌介导的蘸花法遗传转化拟南芥 |
| 4.3.2 转基因拟南芥植株的草铵膦抗性筛选 |
| 4.3.3 NaCl胁迫下转基因株系根长测定 |
| 4.3.4 SaLDC超表达拟南芥株系的分析 |
| 4.3.5 NaCl胁迫对转基因株系sa2的影响 |
| 4.3.6 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 转基因拟南芥植株的获得 |
| 4.4.2 NaCl胁迫对转基因株系根长的影响 |
| 4.4.3 SaLDC超表达转基因拟南芥基因表达分析 |
| 4.4.4 转基因株系sa2对NaCl胁迫的响应 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 缩略语对照表 |
| 作者简介 |
（2）种子特异表达SiDGAT1转基因大豆新种质的创制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 高油大豆育种现状 |
| 1.2 大豆遗传转化体系研究进展 |
| 1.2.1 大豆再生体系研究进展 |
| 1.2.2 大豆转基因的主要方法 |
| 1.2.3 农杆菌介导大豆遗传转化的研究进展 |
| 1.3 植物启动子的研究进展 |
| 1.3.1 启动子的结构 |
| 1.3.2 启动子的种类 |
| 1.4 植物二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的研究进展 |
| 1.4.1 DGAT1在TAG合成过程中的作用 |
| 1.4.2 SiDGAT1 的发现及其功能研究 |
| 1.5 研究目的与意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料及仪器 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 载体构建的基本流程 |
| 2.2.2 农杆菌介导大豆遗传转化的基本流程 |
| 2.2.3 转SiDGAT1 基因大豆植株草铵膦抗性检测 |
| 2.2.4 转SiDGAT1 基因大豆植株Bar蛋白试纸条检测 |
| 2.2.5 转SiDGAT1 基因大豆植株的PCR检测 |
| 2.2.6 转SiDGAT1 基因大豆植株的q RT-PCR检测 |
| 2.2.7 转SiDGAT1 基因大豆植株的Western Blot检测 |
| 2.2.8 转SiDGAT1 基因大豆子粒油分测量 |
| 2.2.9 转SiDGAT1 基因大豆子粒大小测量 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 载体构建 |
| 3.2 农杆菌介导大豆遗传转化 |
| 3.2.1 质粒转化农杆菌 |
| 3.2.2 PBA002-P8-SiDGAT1 质粒的大豆遗传转化 |
| 3.3 转SiDGAT1 基因大豆植株的鉴定 |
| 3.3.1 转SiDGAT1 基因大豆植株草铵膦抗性检测 |
| 3.3.2 转SiDGAT1 基因大豆植株Bar蛋白试纸条检测 |
| 3.3.3 转SiDGAT1 基因大豆植株的PCR检测 |
| 3.3.4 转SiDGAT1 基因大豆植株的Western blot检测 |
| 3.3.5 转SiDGAT1 基因大豆植株的q RT-PCR分析 |
| 3.3.6 转SiDGAT1 基因大豆种子油分含量测定 |
| 3.3.7 转SiDGAT1 基因大豆子粒大小测量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转SiDGAT1 基因大豆植株的检测 |
| 4.2 种子特异表达SiDGAT1 转基因大豆植株的基因表达量 |
| 4.3 SiDGAT1 基因过量表达对大豆油分和子粒大小的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（3）外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大豆的遗传转化方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导法 |
| 1.2.2 基因枪转化法 |
| 1.2.3 聚乙二醇转化法 |
| 1.2.4 花粉管通道法 |
| 1.2 外源基因表达的影响因素 |
| 1.2.1 外源基因插入特性对基因表达的影响 |
| 1.2.2 宿主调控对外源基因表达的影响 |
| 1.2.3 外界环境条件对外源基因表达的影响 |
| 1.3 植物中DNA甲基化 |
| 1.3.1 DNA甲基化的产生机制 |
| 1.3.2 DNA甲基化的功能 |
| 1.3.3 DNA甲基化的研究方法 |
| 1.4 原生质体转化与外源基因表达 |
| 1.4.1 原生质体转化方法在基因功能研究中的优势 |
| 1.4.2 原生质转化方法在基因功能研究中的应用 |
| 1.4.3 原生质转化方法的影响因素 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 数据处理与计算 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化 |
| 2.2.2 不同大豆品种丛生芽诱导效率 |
| 2.2.3 不同大豆品种丛生芽伸长效率 |
| 2.2.4 不同大豆品种生根效率 |
| 2.2.5 不同大豆品种遗传转化效率 |
| 2.3 本章小结 |
| 2.3.1 结论 |
| 2.3.2 讨论 |
| 第三章 大豆原生质体细胞分离和瞬时转化体系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.4 数据处理与计算 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 大豆原生质体制备和活力检测 |
| 3.2.2 组织材料培养时间对原生质体产量及活力的影响 |
| 3.2.3 预处理液中甘露醇含量对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.4 酶解液成份对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.5 酶解时间对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.6 不同组织材料类型对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.7 大豆原生质体中外源基因的瞬时表达 |
| 3.3 本章小结 |
| 3.3.1 结论 |
| 3.3.2 讨论 |
| 第四章 不同遗传转化效率大豆品种外源基因表达的影响因素研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 数据处理与计算 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的制备 |
| 4.2.2 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的转化效率 |
| 4.2.3 雌二醇诱导时间对大豆原生质体转化效率的影响 |
| 4.2.4 雌二醇浓度对大豆原生质体转化效率的影响 |
| 4.2.5 培养时间对不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞外源荧光蛋白表达的影响 |
| 4.2.6 不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞内外源基因的表达差异 |
| 4.2.7 蛋白酶抑制剂对外源基因表达的影响 |
| 4.2.8 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化酶相关编码基因表达水平 |
| 4.2.9 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化水平差异 |
| 4.2.10 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因表达水平的影响 |
| 4.2.11 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因甲基化水平的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 4.3.1 结论 |
| 4.3.2 讨论 |
| 第五章 5-AZAC对农杆菌介导的大豆遗传转化的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.3 数据处理与计算 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同5-Azac处理浓度对大豆遗传转化的影响 |
| 5.2.2 不同5-Azac使用方式对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响 |
| 5.2.3 5-Azac对不同大豆品种抗性丛生芽诱导效率的影响 |
| 5.3 本章小结 |
| 5.3.1 结论 |
| 5.3.2 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 大豆的遗传转化效率具有显着的基因型差异 |
| 6.2 建立高效的大豆原生质体细胞分离和瞬时转化表达体系 |
| 6.3 DNA甲基化能够造成大豆品种间外源基因表达水平差异 |
| 6.4 甲基化抑制剂5-AZAC能够显着的提高大豆遗传转化过程中抗性丛生芽的诱导效率 |
| 6.5 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（4）大豆遗传转化方法及再生体系研究进展（论文提纲范文）
| 1 大豆遗传转化体系 |
| 1.1 不定芽器官发生再生体系 |
| 1.2 体细胞胚胎发生再生体系 |
| 2 大豆遗传转化方法 |
| 2.1 农杆菌介导法 |
| 2.2 基因枪法 |
| 2.3 花粉管通道法 |
| 2.4 其他转化方法 |
| 3 影响大豆转化效率的主要因素 |
| 3.1 基因型 |
| 3.2 农杆菌菌株 |
| 3.3 抗氧化剂 |
| 4 展望 |
（5）HN-ZMZ-1基因克隆及农杆菌转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 农杆菌介导的遗传转化 |
| 1.1.1 农杆菌转化的方法 |
| 1.1.2 受体基因型和生长状态对转化的影响 |
| 1.1.3 农杆菌相关基因表达 |
| 1.2 大豆遗传转化研究 |
| 1.2.1 大豆遗传转化方法 |
| 1.2.2 菌株种类及生长状态对大豆遗传转化的影响 |
| 1.2.3 受体基因型和生长状态对转化影响 |
| 1.2.4 其他因素对大豆遗传转化的影响 |
| 1.3 景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPas)研究进展 |
| 1.3.1 景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)功能概述 |
| 1.3.2 SBPase的结构 |
| 1.3.3 SBPase的功能研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 材料与方法 |
| 2.1 大豆农杆菌转化体系的优化 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验培养基配制 |
| 2.1.3 大豆种子萌发 |
| 2.1.4 外植体制备与农杆菌侵染 |
| 2.1.5 共培养 |
| 2.1.6 丛生芽诱导及筛选 |
| 2.2 HN-ZMZ-1基因的克隆及植物表达载体的构建 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 培养基配制 |
| 2.2.3 试验方法 |
| 2.3 农杆菌介导HN-ZMZ-1基因的大豆遗传转化 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.2 培养基配制 |
| 2.3.3 大豆遗传转化 |
| 2.3.4 转基因植株叶片DNA提取及PCR检测 |
| 2.3.5 转基因植株叶片RNA提取及qPCR检测 |
| 结果与分析 |
| 3.1 大豆农杆菌转化体系的优化 |
| 3.1.1 农杆菌侵染方式的改变对农杆菌转化的影响 |
| 3.1.2 共培养光照时间对大豆子叶节抗性丛生芽的诱导 |
| 3.1.3 6-BA浓度对大豆子叶节抗性丛生芽的诱导 |
| 3.2 HN-ZMZ-1基因的克隆及植物表达载体的构建 |
| 3.2.1 大豆叶片RNA提取及cDNA检测 |
| 3.2.2 HN-ZMZ-1基因克隆 |
| 3.2.3 HN-ZMZ-1基因序列的生物学分析 |
| 3.2.4 表达载体pEarleyGate100-HN-ZMZ-1的构建 |
| 3.2.5 植物表达载体pEarleyGate100-HN-ZMZ-1转化农杆菌 |
| 3.3 转HN-ZMZ-1基因阳性植株的T0代获得 |
| 3.3.1 HN-ZMZ-1基因大豆遗传转化 |
| 3.3.2 T0代转HN-ZMZ-1基因阳性植株的鉴定 |
| 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 大豆遗传转化体系优化 |
| 4.2.2 HN-ZMZ-1基因的克隆及转基因分析 |
| 参考文献 |
| 附录1 表-试验仪器及设备 |
| 附录2 表-试验药品 |
| 致谢 |
| 攻读硕士论文期间发表论文 |
（6）农杆菌介导的大豆不同外植体转化效率研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 大豆组织培养技术 |
| 1.1 大豆转化体系 |
| 1.2 大豆再生体系 |
| 2 影响大豆遗传转化效率的因素 |
| 2.1 品种对大豆遗传转化的影响 |
| 2.2 外界条件对大豆遗传转化的影响 |
| 2.3 激素对大豆遗传转化的影响 |
| 2.4 其他因素对大豆遗传转化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 测定项目及方法 |
| 1.3.1 子叶节的抗性丛生芽率 |
| 1.3.2 子叶节GUS染色率 |
| 1.3.3 愈伤组织的GUS染色率 |
| 1.4 试验数据分析方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 不同品种大豆的子叶节转化抗性差异 |
| 2.1.1 不同品种大豆的发芽率结果 |
| 2.1.2 不同品种大豆的抗PPT出芽率的比较 |
| 2.1.3 不同品种大豆的gus染色率的比较 |
| 2.1.4 抗性品种的初次筛选 |
| 2.1.5 高转化效率品种 |
| 2.1.6 低转化效率品种 |
| 2.2 不同品种大豆的愈伤组织转化抗性差异 |
| 2.2.1 愈伤组织转化的瞬时GUS染色率 |
| 2.2.2 不同品种大豆抗性的第二次筛选 |
| 2.3 不同外植体中的抗性差异比较 |
| 2.3.1 高转化效率品种中愈伤组织转化情况 |
| 2.3.3 低转化效率品种中愈伤组织转化情况 |
| 3 结论和讨论 |
| 3.1 同种外植体在不同品种中转化效率差异 |
| 3.2 不同外植体在同种大豆品种中的转化效率差异 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）农杆菌介导的大豆遗传转化方法优化及KN1和GID1基因对大豆再生和遗传转化效率的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 国内外大豆转基因研究进展 |
| 1.1 大豆转基因转化方法的研究进展 |
| 1.1.1 农杆菌介导法 |
| 1.1.2 花粉管通道法 |
| 1.1.3 基因枪转化法 |
| 1.1.4 电激法 |
| 1.2 农杆菌介导法转化大豆的影响因素 |
| 1.2.1 受体材料 |
| 1.2.2 外植体 |
| 1.2.3 农杆菌菌株侵染能力及菌株活性 |
| 1.2.4 培养基成分 |
| 1.2.5 促进再生的相关基因 |
| 2 细胞分裂素对植株生长的影响 |
| 2.1 细胞分裂素研究进展 |
| 2.1.1 细胞分裂素生物合成和代谢 |
| 2.1.2 细胞分裂素信号传导途径 |
| 2.1.3 细胞分裂素对植株生长发育的影响 |
| 2.2 转录因子KNOX发现 |
| 2.3 转录因子KNOX的调控 |
| 2.3.1 转录因子KNOX的调控网络 |
| 2.3.2 转录因子KNOX与其他激素的相互作用 |
| 2.4 KNOX基因在植物中的作用 |
| 2.5 KNOX基因在植物遗传转化中的作用 |
| 2.5.1 作为内源激素基因 |
| 2.5.2 作为新的筛选标记 |
| 3 赤霉素受体蛋白GID1研究进展 |
| 3.1 赤霉素研究进展 |
| 3.1.1 赤霉素生物合成途径 |
| 3.1.2 赤霉素信号传导途径 |
| 3.1.3 其他激素对赤霉素的调控 |
| 3.2 赤霉素受体蛋白GID1研究进展 |
| 3.2.1 赤霉素受体的发现 |
| 3.2.2 赤霉素受体的研究进展 |
| 4 本研究目的、意义及内容 |
| 4.1 本研究的目的和意义 |
| 4.2 本研究主要内容 |
| 5 本研究技术路线 |
| 5.1 农杆菌介导的大豆转化体系优化 |
| 5.2 细胞分裂素相关基因KN1对大豆再生和转化效率及植株表型的影响 |
| 5.3 赤霉素受体基因GmGID1s对大豆再生和转化效率的影响及功能分析 |
| 第二章 农杆菌介导的大豆转化体系优化 |
| 1 材料及试剂 |
| 1.1 大豆品种 |
| 1.2 载体及菌株 |
| 1.3 主要仪器及试剂 |
| 1.3.1 试验仪器设备 |
| 1.3.2 主要激素和试剂 |
| 1.4 培养基 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化流程图 |
| 2.2 农杆菌介导的大豆遗传转化步骤 |
| 2.2.1 大豆种子的挑选及消毒 |
| 2.2.2 大豆种子的吸胀 |
| 2.2.3 农杆菌的活化及侵染液的制备 |
| 2.2.4 外植体的制备与农杆菌侵染 |
| 2.2.5 共培养及侵染效率统计 |
| 2.2.6 丛生芽诱导 |
| 2.2.7 不定芽伸长 |
| 2.2.8 幼苗生根 |
| 2.2.9 幼苗的移栽与驯化 |
| 2.2.10 阳性苗和阳性后代的检测方法及阳性后代拷贝数计算方法 |
| 2.2.11 阳性苗收种、繁殖 |
| 3 影响大豆遗传转化效率的因素试验设计 |
| 3.1 影响农杆菌侵染效率的因素试验设计 |
| 3.1.1 农杆菌重悬液中是否添加DTT比较试验 |
| 3.1.2 农杆菌不同收菌浓度比较试验 |
| 3.1.3 外植体不同获取方式比较试验 |
| 3.1.4 不同共培养时间比较试验 |
| 3.1.5 不同大豆品种比较试验 |
| 3.2 影响大豆丛生芽伸长率和转化效率的因素试验设计 |
| 3.2.1 不同浓度赤霉素和生长素组合的比较试验 |
| 3.2.2 是否添加抗氧化剂AgNO_3或Vc的比较试验 |
| 3.3 数据统计分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 不同因素对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.1 重悬液是否添加DTT对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.2 农杆菌不同收菌浓度对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.3 不同外植体获取方式对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.4 共培养不同时间对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.5 不同大豆品种对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.2 不同因素对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 4.2.1 不同激素组合对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 4.2.2 添加抗氧化剂对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 5 转基因后代的检测方法比较及外源基因拷贝数的检测 |
| 5.1 对比不同方法检测转基因阳性苗 |
| 5.2 绝对定量PCR检测转基因植株外源基因的拷贝数 |
| 6 讨论 |
| 6.1 添加抗氧化剂DTT与农杆菌侵染效率的关系 |
| 6.2 农杆菌生长周期与农杆菌侵染效率的关系 |
| 6.3 大豆外植体获取方式的选择 |
| 6.4 共培养时间与农杆菌侵染效率的关系 |
| 6.5 不同大豆品种与农杆菌侵染效率的关系 |
| 6.6 GA_3及IAA与大豆丛生芽伸长率和转化效率的关系 |
| 6.7 抗氧化剂AgNO_3和Vc与大豆丛生芽伸长率和转化效率的关系 |
| 6.8 阳性植株的鉴定方法及外源基因拷贝数检测方法比较 |
| 第三章 KN1基因对大豆再生和遗传转化效率及植株表型的影响 |
| 1 试验材料与试剂 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 大豆受体品种 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.2.1 工具酶和试剂盒 |
| 1.2.2 PCR引物和测序 |
| 1.2.3 常用培养基和配制方法 |
| 1.3 试验仪器设备 |
| 2 试验方法与试验设计 |
| 2.1 载体pCAMBIA3301-35S-NOS的构建 |
| 2.1.1 片段35S-NOS获得 |
| 2.1.2 35S-NOS连入载体pCAMBIA3301 |
| 2.2 植物双元表达载体pCAMBIA3301-35S-KN1-NOS的构建 |
| 2.2.1 目的基因KN1的获得 |
| 2.2.2 重组质粒pCAMBIA3301-35S-KN1-NOS的构建 |
| 2.2.3 重组质粒的筛选和测序验证 |
| 2.2.4 菌种保存 |
| 2.3 转化根癌农杆菌 |
| 2.3.1 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 重组质粒转化EHA105感受态细胞 |
| 2.3.3 重组质粒pCAMBIA3301-35S-KN1-NOS的PCR鉴定 |
| 2.3.4 菌种保存 |
| 2.4 农杆菌介导的大豆子叶节转化 |
| 2.5 过表达KN1对大豆再生和转化效率的影响 |
| 2.5.1 培养基中细胞分裂素类激素添加与否的比较试验 |
| 2.5.2 不同草丁膦筛选浓度下对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 2.6 过表达KN1转基因后代表型分析 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 植物表达载体的构建 |
| 3.2 KN1基因对大豆遗传转化的影响 |
| 3.2.1 KN1基因在芽诱导时期(SI)对丛生芽的影响 |
| 3.2.2 KN1基因在芽伸长时期(SE)对芽伸长的影响 |
| 3.2.3 不同草丁膦筛选浓度下KN1基因对丛生芽伸长率和转化率的影响 |
| 3.3 过表达KN1基因大豆阳性后代植株的表型 |
| 3.3.1 T_0代过表达KN1基因阳性苗和转对照载体阳性苗的比较 |
| 3.3.2 T_1代过表达KN1基因阳性苗和转对照载体阳性苗的比较 |
| 3.3.3 T_2代过表达KN1基因阳性苗和转对照载体阳性苗的比较 |
| 3.3.4 T_2代过表达KN1基因植株中KN1的表达量分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 KN1基因对大豆再生和转化效率的影响 |
| 4.2 KN1基因对植株表型的影响 |
| 第四章 大豆赤霉素受体基因GmGID1s对大豆遗传转化效率及植株表型的影响 |
| 1 试验材料、试剂与仪器 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 工具酶和试剂盒 |
| 1.2.1 工具酶和试剂盒 |
| 1.2.2 菌株和质粒 |
| 1.2.3 PCR引物和测序 |
| 1.2.4 常用培养基和配制方法 |
| 1.3 所用试验仪器 |
| 2 试验方法及试验设计 |
| 2.1 GmGID1s基因的筛选 |
| 2.2 GmGID1s基因的序列分析 |
| 2.3 GmGID1s基因的表达分析 |
| 2.4 植物总RNA的提取 |
| 2.5 荧光定量PCR |
| 2.6 数据分析方法 |
| 2.7 植物双元表达载体pCAMBIA3301-35S-GID1-NOS的构建 |
| 2.7.1 目的基因GmGID1s的获得 |
| 2.7.2 重组质粒pCAMBIA3301-35S-GID1-NOS的构建 |
| 2.7.3 重组质粒的筛选和测序验证 |
| 2.7.4 菌种保存 |
| 2.8 转化根癌农杆菌 |
| 2.9 农杆菌介导的大豆子叶节转化 |
| 2.10 GmGID1s对大豆丛生芽伸长率和遗传转化效率的影响试验设计 |
| 2.11 过表达GmGID1s基因对植株表型的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大豆GmGID1s基因的生物信息学分析 |
| 3.2 赤霉素处理后GmGID1s的表达量分析 |
| 3.3 植物表达载体的构建 |
| 3.4 GmGID1s基因对大豆遗传转化的影响 |
| 3.4.1 GmGID1s对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 3.4.2 GmGID1-2在不同草丁膦筛选浓度下对伸长率和转化效率的影响 |
| 3.5 过表达GmGID1-2基因对大豆外植物和后代植株表型的影响 |
| 3.5.1 过表达GmGID1-2基因在转化过程中对外植体表型的影响 |
| 3.5.2 过表达GmGID1-2基因对大豆植株表型的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 大豆组织培养各培养基成分 |
| 附录2 试验方法 |
| 攻读博士学位期间发表论文和申请专利 |
| 致谢 |
（8）大豆品质改良相关基因GmAGL1,GmDof11和GmDof4的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表及其英汉对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大豆遗传转化中常用的方法 |
| 1.1 农杆菌介导法 |
| 1.2 基因枪法 |
| 1.3 其他转化技术的应用 |
| 2 转基因方法在大豆种子成分和农艺性状改良中的应用 |
| 2.1 改良种子成分 |
| 2.2 增强生物和非生物抗性 |
| 3 植物转录因子相关研究 |
| 3.1 转录因子的特征 |
| 3.2 MADS-box转录因子 |
| 3.3 Dof转录因子 |
| 4 大豆转基因研究的目的和意义 |
| 4.1 转基因方法对大豆研究的意义 |
| 4.2 大豆转基因研究的发展前景 |
| 4.3 本文研究的目的和意义 |
| 第二章 大豆遗传转化受体筛选及MADS-box基因GmSEP3遗传转化初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同基因型大豆候选材料萌发率比较 |
| 2.2 不同基因型大豆候选材料GUS染色情况 |
| 2.3 候选大豆材料再生和增殖情况 |
| 2.4 候选大豆材料对不同筛选剂的敏感性比较 |
| 2.5 GmSEP3转基因大豆植株的获得和阳性鉴定 |
| 2.6 GmSEP3过表达植株的表型观察 |
| 3 讨论 |
| 3.1 受体材料的选择对大豆转基因研究的影响 |
| 3.2 不同基因型大豆对不同筛选剂的敏感性存在差异 |
| 3.3 MADS-box基因GmSEP3的作用 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 过表达MADS-box基因GmAGL1遗传转化研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因植株的获得和GmAGL1表达模式 |
| 2.2 GmAGL1过表达植株出现早花、早熟表型,花器官发育也受到影响 |
| 2.3 SD/LD条件下转基因植株都比对照提前开花 |
| 2.4 转基因大豆植株的农艺性状分析 |
| 2.5 过表达GmAGL1转基因植株的转录组分析 |
| 2.6 MADS-box基因表达差异和MADS-box蛋白含量分析 |
| 2.7 转基因植株光周期途径基因出现显着差异 |
| 2.8 其他开花调控途径的基因表达变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MADS-box基因影响花器官发育 |
| 3.2 GmAGL1主要通过光周期途径促进开花 |
| 3.3 过表达GmAGL1对大豆生产的影响 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 过表达Dof基因GmDof11基因遗传转化初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因植株的获得和阳性鉴定 |
| 2.2 转基因植株的GmDof11表达量分析 |
| 2.3 转基因植株的拷贝数鉴定 |
| 2.4 转基因植株的农艺性状分析 |
| 2.5 转基因植株的蛋白和油脂含量分析 |
| 2.6 T3代转基因植株LiCl耐受性研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 以GmCAX1作为抗性标记基因的可行性 |
| 3.2 GmDof11转录因子的作用 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 过表达Dof基因GmDof4基因遗传转化初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因植株的获得和阳性鉴定 |
| 2.2 转基因株系的GmDof4相对表达量分析 |
| 2.3 转基因植株的拷贝数鉴定 |
| 2.4 转基因植株的农艺性状分析 |
| 2.5 转基因植株的蛋白和油脂含量分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GmDof4基因的主要功能 |
| 3.2 植物分枝的影响因素及大豆分枝的相关研究 |
| 3.3 过表达GmDof4基因对大豆生产的意义 |
| 4 本章小结 |
| 全文结论和创新点 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表或待发表的研究论文 |
| 致谢 |
（9）大豆科丰14子叶节遗传转化体系的优化（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2试验方法 |
| 2结果与分析 |
| 2.1农杆菌浸染时间对丛生芽率的影响 |
| 2.2硫代硫酸钠对共培养阶段的影响 |
| 2.4丛生芽和转化植株鉴定 |
| 3结论与讨论 |
（10）利用Lyr基因建立大豆安全筛选标记体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 安全性筛选标记基因研究与进展 |
| 1.2 赖氨酸消旋酶的研究 |
| 1.3 转基因大豆研究与应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 双基因标记pBasta-Lyr植物表达载体的构建及农杆菌转化 |
| 3.2 生芽培养基中不同品种大豆赖氨酸筛选压的研究 |
| 3.3 Lyr基因转化大豆筛选体系的研究 |
| 3.4 转基因大豆的分子生物学检测 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 安全筛选标记基因 |
| 4.2 大豆的遗传转化 |
| 4.3 大豆子叶节转化的筛选体系分析 |
| 4.4 转基因大豆的分子检测 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、大豆子叶节再生及农杆菌介导转化研究（论文参考文献）
- [1]苦豆子遗传转化体系的建立和盐胁迫下SaLDC表达分析[D]. 周玉梅. 宁夏大学, 2020(03)
- [2]种子特异表达SiDGAT1转基因大豆新种质的创制[D]. 孙英楠. 东北农业大学, 2020(05)
- [3]外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究[D]. 赵强. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [4]大豆遗传转化方法及再生体系研究进展[J]. 王立平,何展泳,年海,王宏杰,马启彬. 广东农业科学, 2020(03)
- [5]HN-ZMZ-1基因克隆及农杆菌转化研究[D]. 杨柳. 沈阳农业大学, 2019(03)
- [6]农杆菌介导的大豆不同外植体转化效率研究[D]. 王蕊. 沈阳农业大学, 2018(04)
- [7]农杆菌介导的大豆遗传转化方法优化及KN1和GID1基因对大豆再生和遗传转化效率的影响[D]. 李姝璇. 南京农业大学, 2018(05)
- [8]大豆品质改良相关基因GmAGL1,GmDof11和GmDof4的遗传转化研究[D]. 曾旋睿. 南京农业大学, 2017(07)
- [9]大豆科丰14子叶节遗传转化体系的优化[J]. 王伟,姚嘉龙,熊鹤雯,吴志慧,王程,郭蓓,谢皓. 大豆科学, 2015(03)
- [10]利用Lyr基因建立大豆安全筛选标记体系的研究[D]. 靳京. 吉林农业大学, 2015(03)