一、人膜联蛋白Ⅴ基因的克隆及原核表达（论文文献综述）
李妮[1]（2020）在《药物新适应症的开发 ——抗肠道病毒EV71的功效评价及机理研究》文中指出肠道病毒轻则引起手足口病,重则引起神经系统并发症甚至死亡。绝大多数重症和死亡病例都是由EV71引起的。EV71在世界各地的广泛流行给人类（特别是婴幼儿）的健康带来了严重的威胁。虽然现在国家食品药品监督管理局批准了疫苗的上市,但疫苗只能预防EV71的感染。目前,由于对已感染EV71患者的治疗缺乏特异性的药物,因此开发安全高效抗EV71药物迫在眉睫。FDA批准的化合物成分、作用靶点及安全信息已知,开发其抗EV71的新适应症,不仅节省了抗EV71药物开发的时间和财力,同时为抗EV71药物研制提供了新信息,另外还丰富了化合物本身抗EV71的功能。因此,本研究针对FDA批准的1430种化合物,首先经初筛和复筛得到了13种抗EV71活性好的化合物,结合这13种化合物的性质和抗EV71活性,我们选定了3号、5号和12号这三种目标化合物进行深入研究。然后,我们针对这三种目标化合物进行了抗EV71功效评价,三种化合物都具有较高治疗指数（分别为>17.76、>18.79、21.31）,并且都能很好的保护EV71引起的细胞病变,也都能明显降低EV71的子代病毒产量。功效评价结果说明三种目标化合物均具有较好的抗EV71活性。最后,我们研究了这三种目标化合物抗EV71作用的机理。实验结果表明三种化合物在体外均不具有直接杀伤EV71的能力;化合物3在预防作用模式、混合作用模式和治疗作用模式对EV71均表现出抑制作用,而化合物5和12仅在治疗作用模式下对EV71起到抑制作用;三种化合物通过抑制EV71复制的早期阶段从而降低了EV71子代病毒产量和RNA水平;化合物3和12对2A蛋白酶活性无影响但在体外明显抑制了3C蛋白的酶活性,而化合物5对2A蛋白酶和3C蛋白酶活性都没有表现出抑制作用。实验结果表明,这三种化合物均具有较强的抗EV71活性;化合物3和12可能通过作用于3C蛋白酶抑制EV71的复制增殖,我们是首次发现它们能作用于3C蛋白酶这一靶点;也是首次发现化合物5和12具有抗病毒活性。因此,化合物3、5和12具有进一步开发其抗EV71新适应症的潜能。
王丽[2]（2020）在《BVDV非结构蛋白Npro介导泛素化降解ELF4的分子机制研究》文中提出牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus）是一种单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、瘟病毒属的成员,主要引起牛的呼吸道症状,腹泻,黏膜糜烂,流产或产出先天缺陷的犊牛等症状,还能引起白细胞减少和免疫抑制。Npro蛋白是ORF中编码的第一种蛋白质,在瘟病毒属中高度保守,具有蛋白酶活性,但目前尚不能完全解释其蛋白水解作用及参与调控免疫抑制的机理。据报道BVDV Npro蛋白通过蛋白酶体途径降解IRF3,并且E1泛素激活酶起到了作用;转录因子ELF4可形成二聚体入核激活I型IFN启动子,诱导I型IFN产生,并参与机体的抗病毒先天免疫反应。我们前期研究证明:BVDV非结构蛋白Npro通过蛋白酶体途径降解BoELF4,负调控I型干扰素的表达;但是Npro蛋白降解ELF4蛋白过程中的作用机制尚不完全清楚。由此,本研究探讨了BVDV Npro蛋白通过泛素化途径降解ELF4的分子机制,以及筛选了与Npro蛋白互作的蛋白,为深入了解Npro蛋白的功能、BVDV感染机体后的免疫逃逸机制及建立有效的免疫防控措施提供理论依据。首先,本研究构建了pcDNA3.1-Npro真核表达质粒,PCR扩增目的基因,胶回收后,对目的基因及表达载体进行双酶切鉴定,之后进行连接与转化,并将鉴定正确的重组质粒pcDNA3.1-Npro转染至293T细胞中,通过Western blot验证。结果显示,在23KDa处出现明显的目的条带,与预期大小一致,证明BVDV Npro蛋白真核表达载体构建成功。其次,利用生物信息学软件预测了Npro蛋白与ELF4蛋白的互作及潜在泛素化位点;并利用Co-IP方法验证了两个蛋白的互作关系。结果显示,BVDV Npro蛋白与转录因子ELF4发生共沉淀;BVDV Npro蛋白通过泛素化降解ELF4,并通过K48位多聚泛素化降解ELF4。以上结果表明,BVDV Npro蛋白与转录因子ELF4存在相互作用,并且BVDV Npro蛋白通过K48位多聚泛素化降解ELF4。最后,将pcDNA3.1-Npro真核表达质粒转染至MDBK细胞中,利用Co-IP方法验证,并将其送去做质谱,对鉴定结果进行GO分析。之后,我们从质谱结果中筛选出25种候选蛋白,重点对Hsp70蛋白进行验证。结果,成功构建了pcDNA3.0-Hsp70真核表达质粒;Co-IP结果显示,BVDV Npro蛋白与Hsp70蛋白发生共沉淀;Hsp70蛋白可以降解BoELF4,当加入Npro质粒时,降解ELF4更加明显。以上结果表明,Hsp70蛋白与Npro蛋白存在相互作用,并且二者可能协同降解ELF4。综上所述,本研究证明了BVDV Npro蛋白与ELF4有相互作用,并通过K48位多聚泛素化降解ELF4;BVDV Npro蛋白与Hsp70有相互作用,并且二者均能协同降解ELF4;Hsp70在协同降解ELF4中的作用机制有待于进一步研究。本研究为深入了解BVDV感染机体后的免疫逃逸机制及建立有效的免疫防控措施提供理论依据。
陈赛,聂纪芹,李聪,谭超[3]（2019）在《Annexin A2单克隆抗体抗肿瘤活性的实验研究》文中提出目的研究人膜联蛋白A2（Annexin A2）单克隆抗体的抗肿瘤活性,探讨Annexin A2在肿瘤发生发展中的作用。方法表达纯化Annexin A2重组蛋白,免疫小鼠及细胞融合制备单克隆抗体,用间接ELISA检测抗体的效价,Western blot和免疫共沉淀检测抗体的特异性。MTT法检测外源性Annexin A2抗体对肿瘤细胞生长的影响,流式细胞术检测其对肿瘤细胞周期的影响,RT-PCR及Quantitative real-time PCR检测对肿瘤细胞周期相关基因的影响,transwell检测其对HepG2细胞的侵袭及迁移的影响。结果 Annexin A2重组蛋白免疫小鼠,获得效价高的单克隆抗体。MTT结果显示,与对照细胞相比,外源抗体能够抑制HepG2细胞的生长。细胞周期相关检测结果显示,Annexin A2蛋白的表达与肿瘤细胞的生长周期相关基因具有相关性。transwell结果显示,外源抗体的处理抑制HepG2细胞的迁移,但促进了HepG2细胞的侵袭。结论 Annexin A2重组蛋白免疫Balb/c小鼠后,获得高滴度特异性的单克隆抗体。获得的Annexin A2单克隆抗体具有抑制生长迁移作用,为肿瘤的诊断及治疗提供了实验依据。
郭鑫鑫[4]（2017）在《细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化》文中指出背景针对自身免疫性疾病以及恶性肿瘤的治疗尚无疗效较好且副作用较少的方法或药物,近年来的研究表明,在上述疾病的发生、发展过程中,抗原特异性T细胞起一定作用。CTLA4作为一种主要的共刺激信号负调节分子,具有阻断T细胞活化的作用;作为CTLA4的单克隆抗体则具有激活T细胞的作用,二者通过对T细胞的调控作用,干预机体免疫微环境,开辟了对上述疾病的新的治疗途径。目的本研究目的在于获得高纯度的细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域（extracellular domain of cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,ex CTLA4）。通过构建ex CTLA4重组表达质粒,并在大肠杆菌Transetta（DE3）中进行重组蛋白的表达。以期获得高纯度的ex CTLA4重组蛋白,为研究其生物学功能或制备人源化的CTLA4单克隆抗体提供基础。方法1.构建原核表达质粒p ET-28a-ex CTLA4。根据人源CTLA4基因序列由公司合成胞外域序列,以此序列为模板,扩增后并构建到p ET-28a载体的相应酶切位点。2.诱导表达ex CTLA4重组蛋白。将测序正确的表达质粒转化至大肠杆菌Transetta（DE3）中,在诱导物IPTG浓度为0.5m M、诱导温度为37°C时,诱导菌体表达蛋白,培养4h后收集菌体,SDS-PAGE检测菌体中的重组蛋白有无表达。3.优化ex CTLA4重组蛋白表达条件。从诱导物浓度IPTG,诱导温度,诱导时间三方面诱导条件进行优化。并在此基础上,设计三水平三因素正交试验,选择最优表达条件。4.纯化ex CTLA4重组蛋白。选择最优条件诱导目的蛋白表达,收集菌体后,超声破碎菌体并收集包涵体,先用低浓度尿素（2M）洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素（8M）溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度ex CTLA4。5.梯度稀释法复性ex CTLA4重组蛋白。用复性缓冲液梯度稀释样品,并经过透析可将变性的重组蛋白复性。6.检测重组蛋白ex CTLA4的生物学活性。利用CTLA4的配体B7-1以及外周血单核细胞（PBMC）,通过相应ELISA试剂盒检测ex CTLA4的生物学活性。结果1.成功构建表达质粒p ET-28a-ex CTLA4,测序后序列与已知序列经BLAST比对完全一致。2.成功诱导重组蛋白的表达,获得了ex CTLA4在Transetta（DE3）中的最佳诱导条件,即在0.75m M IPTG、25°C下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在。3.通过镍离子亲和层析纯化及复性获得高纯度重组蛋白,经Western blot鉴定为CTLA4。4.经过ELISA检测鉴定,纯化的ex CTLA4具有生物学活性。结论本研究构建了ex CTLA4重组表达质粒,获得了ex CTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件以及最佳优化结果,得到了具有生物学活性的重组蛋白,为该蛋白的应用以及后期的抗体筛选奠定了基础。
王冰,高萍,牛诚诚,李善玉[5]（2015）在《人膜联蛋白A3的原核表达及纯化》文中提出目的原核表达人膜联蛋白（annexin,ANX）A3（ANX A3）,并进行纯化。方法提取人胎盘样品总RNA,反转录建立c DNA文库,用KOD-Plus高保真DNA聚合酶扩增anx A3基因编码区全长,连接至克隆载体p EASY-Blunt上,测序鉴定。用primix extaq酶重新扩增anx A3基因,与表达载体p EASY-E1连接,构建重组表达质粒p EASY-anx A3,转化E.coli Transetta DE3,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His纯化介质及Bio-Rad Bio Logic Duo Flow Chromatography Systems纯化后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定,阳性克隆可扩增出972 bp的目的片段,与NCBI中Gen Bank上报道的anx A3序列完全一致。纯化的重组蛋白相对分子质量约为36 000,可与鼠Anti 6×His-Tag单克隆抗体特异性结合,浓度为400μg/ml。结论成功构建了重组原核表达质粒p EASY-anx A3,并在E.coli Transetta DE3中表达了重组蛋白,为进一步研究ANX A3在哮喘病的起因和形成中的作用及机制奠定了基础。
卫春晓,李天丽,索延乐[6]（2015）在《带科绦虫的膜联蛋白研究进展》文中研究表明膜联蛋白是一类依赖钙离子的磷脂结合蛋白家族。这类蛋白广泛存在于多种生物,如哺乳动物、霉菌和植物等物种中,常常与质膜或内膜系统相结合,具有依赖于钙离子的磷脂结合、抗凝合、抗炎症等生物学活性。由于膜联蛋白具备与钙离子结合的能力,因此膜联蛋白能够参与一系列的依赖于钙离
皮亚洲[7]（2013）在《RKIP的克隆、表达及其影响肿瘤细胞迁移和细胞凋亡检测性质初步研究》文中研究指明Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein, RKIP）是磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP）家族的一员,在各种生物中广泛存在,其具有对细胞内多种信号转导通路的调节作用,RKIP在膜的生物合成、精子发生、神经发育和细胞凋亡等生理过程中发挥重要作用,并参与了老年痴呆症及糖尿病等的病理过程。近年来的研究表明RKIP也可以抑制肿瘤细胞的转移。转移是一个复杂的、多步骤的、癌细胞和宿主相互作用的过程。肿瘤细胞从原初肿瘤病灶逃逸,进入循环系统,然后侵袭到一个远距离的组织位点,在该靶位点生长成为一个肉眼可见的肿瘤。抑制转移过程的基因称为转移抑制基因,它并不抑制原初肿瘤的发生。转移抑制基因有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。在肿瘤细胞中,RKIP的异常表达起着至关重要的作用。近年来,研究人员证实RKIP在前列腺癌肿具有抗肿瘤细胞转移的功能。研究人员比较了RKIP在未转移的前列腺癌细胞和已经转移的前列腺癌细胞中的表达水平,实验表明,发生转移的前列腺癌细胞中的RKIP表达水平要低于未发生转移的前列腺癌细胞中的表达水平。免疫组化显示,在正常的和初期的前列腺癌细胞中RKIP表达水平较高。同时,在前列腺癌细胞转移过程中,RKIP的表达下调甚至消失。恢复RKIP蛋白在转移的前列腺癌细胞中的表达可以降低细胞的侵袭性。此外,在小鼠原位注射肿瘤细胞试验中,恢复RKIP的表达可以抑制自发性的肺转移,但不抑制肿瘤细胞的生长。因此,RKIP可以抑制肿瘤细胞的转移,但不抑制肿瘤的发生。RKIP相对分子质量为23 kDa,是包含187个氨基酸残基组成的单链蛋白。免疫组织化学证实RKIP存在于细胞质和质膜。RKIP的晶体结构表明,不同种属的PEBPs具有相似的拓扑结构：中央为一个大的6片层组成p折叠,一侧有一个三片层组成的较小的β折叠,C端有两个位螺旋。在该结构中有一个高度保守的磷酸盐结合袋（phosphate-binding pocket）,对PEBP的功能非常重要。在细胞凋亡过程中,磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）由细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧,经荧光标记或放射性标记的Annexin V可以特异性结合磷脂酰丝氨酸,与染色质的荧光染料碘化丙啶（PI）联用可以用来检测细胞凋亡。细胞凋亡时细胞膜完整PI无法进入细胞内呈阴性,而标记的Annexin V可以和细胞膜结合呈阳性,区别于细胞坏死时的双阳性。作为细胞膜另一重要组成部分磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）在细胞凋亡时也会翻转到细胞膜外侧。RKIP蛋白在细胞外的功能还没有过多的研究,本实验将利用原核表达系统纯化出RKIP蛋白以及荧光标记的RKIP蛋白,分别用来观察RKIP蛋白在细胞外和肿瘤细胞转移的关系和观察EGFP-RKIP能否像Annexin V,可以检测细胞凋亡。实验最后建立了RKIP的两个变体,分别去掉了N端的β折叠和C端的两个α螺旋,用来观察其对RKIP结构和功能的影响。
李兵[8]（2012）在《棉花（Gossypium hirsutum）膜联蛋白基因克隆鉴定及功能研究》文中认为棉花（?）Jossypium hirsutum)是世界上最重要的经济作物之一,在我国国民经济中占据重要的地位。棉纤维是棉花生产的主要产品,其产量和品质直接决定了棉花生产的产值和效益,分离和鉴定与棉纤维产量和品质相关的基因并探究这些基因调控棉花纤维发育的分子机制,对棉花纤维品质的改良具有重要的理论和实践意义。近年来,已经分离克隆了大量棉纤维发育相关的基因,并对其中一些基因的功能进行了较为深入的研究,但是,有关棉纤维分子发育中棉花膜联蛋白基因的表达调控与功能研究较少。膜联蛋白（annexin）是一类Ca2+及磷脂结合蛋白,广泛存在于动植物的各种组织细胞中,植物膜联蛋白在植物生长发育和环境应答过程中都起着重要作用。为研究棉花膜联蛋白在棉花纤维发育过程中的作用,我们从棉纤维cDNA文库中分离克隆了4个新的膜联蛋白基因（cDNA）,对这些基因的表达调控、启动子活性及其编码蛋白的亚细胞定位和Ca2+结合活性、以及基因功能等方面进行了研究。取得如下研究结果：1、棉花AnnGh基因的分离鉴定及其编码蛋白的结构分析从棉纤维cDNA文库中分离了4个新的膜联蛋白基因的cDNA,依次命名为AnnGh3、 AnnGh4、AnnGh5、AnnGh6。与已知的棉花膜联蛋白序列相比较,这4个基因无论在核苷酸水平还是在氨基酸水平上均具有较高的同源性,相似度达56～95%。这些基因的编码蛋白都含有4个典型的膜联蛋白重复结构域（Ⅰ～Ⅳ）,在第Ⅰ重复和第Ⅳ重复结构域中均含有典型的Ⅱ型Ca2+结合位点（G-X-G-T-{38}-E/D）；此外,在第Ⅰ重复结构域中还含有一个潜在的磷脂和血红素结合位点,在第Ⅲ重复结构中有F-actin结合基序（IRI）,在第Ⅳ重复结构域中还含有GTP结合位点（DXXG）。以上分析结果表明,我们分离克隆的4个新基因属于典型的棉花膜联蛋白家族基因。2、AnnGh蛋白的亚细胞定位分析利用GFP荧光蛋白共定位技术研究了AnnGh蛋白的细胞亚定位。构建了AnnGh3和AnnGh6基因与eGFP的融合表达载体并转化棉花,获得稳定表达AnnGh:GFP荧光蛋白的愈伤组织。激光共聚焦显微镜观察结果显示这两个蛋白均定位于细胞质中。3、AnnGh蛋白钙离子结合活性分析构建了pMal-AnnGh3原核表达载体并成功表达出MBP-AnnGh3融合蛋白。荧光猝灭实验结果显示AnnGh3蛋白能与Ca2+结合,具有钙离子结合活性。4、AnnGhs基因在棉纤维中的表达调控实时定量RT-PCR分析表明,我们所分离鉴定的4个AnnGh基因在棉花中的表达具有组织差异性。AnnGh3、AnnGh4、AnnGh5三个基因均在纤维中优势表达,而AnnGh6主要在根中表达。AnnGh3/4/5在纤维中的表达受纤维发育阶段调控,其转录产物主要集中在伸长期的棉纤维中（3-12DPA）,在15～20DPA的纤维中其表达活性显着下降。此外,这3个基因在纤维中的表达还受植物激素及体外钙离子的浓度调控。在棉纤维发育早期（0～2DPA）,原位杂交实验结果亦显示AnnGh3和AnnGh5基因在纤维细胞和胚珠表皮细胞上有强烈的杂交信号,表明这两个基因可能参与了纤维细胞的起始分化。5、AnnGh3启动子活性分析分离得到了一个793bp的AnnGh3启动子片段,构建了AnnGh3p::GUS融合表达载体转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株。GUS染色分析显示该启动子在3-10天幼苗的子叶、下胚轴和根部有较强的表达活性,随着植株的生长,其活性逐渐减弱。在成熟植株中,该启动子主要在萼片、花丝、果柄基部有较强的表达,花药中也有较弱的表达活性。此外,IAA、黑暗及H202处理均能增强其表达活性。有关该启动子在棉花组织细胞中,特别是纤维中的活性,尚有待分析验证。6、过量表达AnnGh3促进转基因拟南芥表皮毛分化发育将AnnGh3基因转化拟南芥,获得转基因植株。表型分析表明,AnnGh3基因过量表达促使转基因拟南芥莲座叶上表皮毛的密度和长度显着增加。与野生型相比较,转基因植株叶片表皮毛的密度增加了8.3～32.8%,平均长度增加了18～32μn,增长了5.8～10.4%,该结果表明AnnGh3能促进表皮毛的起始分化和伸长发育。鉴于拟南芥叶表皮毛与棉纤维细胞（种子表皮毛）的同源性,上述结果间接证明了AnnGh3基因可能在棉纤维的起始和伸长过程中发挥重要作用。7、植物树脂半薄切片染色方法的改进以棉花的幼根、幼茎、叶、胚珠和玉米幼茎为实验材料,将蕃红-固绿染色、苏木精-伊红染色、氯化铁-苏木精染色方法应用于植物树脂半薄切片研制中,对植物半薄切片染色方法等进行了改进,获得了结构完整、染色清晰半薄切片,建立了一套适合于植物树脂半薄切片制作的染色方法,为相关的实验研究提供了一种较为理想的显微制片技术。
徐康[9]（2012）在《Anxa3表达上调对小鼠肝癌Hca-P细胞株生物学行为的影响》文中指出目的：恶性肿瘤严重威胁人类健康，而淋巴道转移是上皮来源恶性肿瘤细胞的早期主要转移方式，并直接导致了肿瘤患者的死亡率高、预后差，但是恶性肿瘤的淋巴道转移发生机制至今仍不清。目前肿瘤转移的细胞模型被视为研究肿瘤转移分子机制的可靠途径。Anxa3（膜联蛋白A3, Annexin A3）是我们前期采用定量蛋白质组学及生物信息学方法，筛选出的一个可能促进肝癌淋巴道转移关键性因子。但目前Anxa3与肿瘤淋巴道转移明确关系研究鲜有报道。本论文以Anxa3为研究对象，试图构建pEGFP-N1-Anxa3表达载体稳定转染Hca-P细胞获得Anxa3表达水平上调的Hca-p细胞株，探究Anxa3表达水平上调对小鼠肝癌低淋巴道转移力细胞株Hca-P增殖、侵袭、迁移和淋巴道转移能力的影响,以此对肿瘤淋巴道转移机制研究提供一定实验基础数据。方法：1.采用RT-PCR方法获得Anxa3CDS，将纯化后的PCR产物加A尾，与PMD18-T进行T-A克隆，得到T-Anxa3克隆质粒，进行PCR、单双酶切及测序鉴定。将T-Anxa3和pEGFP-N1空质粒分别进行SalⅠ和BamHⅠ双酶切，纯化并连接，获得pEGFP-N1-Anxa3表达质粒，并进行PCR鉴定及单双酶切鉴定。在确定pEGFP-N1-Anxa3载体构建成功后，行测序鉴定。2.采用Sofast转染试剂分别将pEGFP-N1-Anxa3环状质粒及线性化质粒转染Hca-P细胞，转染24h后用含400μg/ml G418的15%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行筛选。3.转染后用有限稀释法筛选单克隆细胞，观察其形态变化，采用Real-time PCR和Western blot分别检测Anxa3在mRNA和蛋白水平的表达水平。以三组细胞（Hca-P细胞，转染pEGFP-N1空质粒的阴性对照，单克隆细胞Hca-Pneo）为实验对象，1)采用CCK-8法检测Anxa3表达上调对Hca-P细胞增殖能力的影响；2) Transwell小室法分析Anxa3表达上调对Hca-P细胞侵袭和迁移能力的影响；3)采用小鼠足垫种植方法分析Anxa3表达上调对Hca-P细胞株体内成瘤及淋巴结转移潜能的影响。结果：1.成功构建T-Anxa3克隆载体和pEGFP-N1-Anxa3真核表达载体，经测序鉴定，所得到载体中Anxa3的CDS序列无误。2.获得单克隆细胞株Hca-Pneo，1)Real-Time PCR结果显示:与Hca-P细胞相比，单克隆细胞株Hca-Pneo中Anxa3在mRNA水平表达上调1.7倍；2) Western blot结果显示单克隆细胞株Hca-Pneo中Anxa3在蛋白水平上表达上调1.6倍；3)CCK-8检测结果显示Anxa3表达上调对Hca-P细胞增殖能力无明显影响；4)Anxa3表达上调促进Hca-P细胞侵袭和迁移能力；5)体内淋巴结转移实验显示，Anxa3表达上调组小鼠足垫接种后原发部位肿瘤溃烂明显，淋巴结转移率高于对照组。结论：1. T-Anxa3克隆质粒构建成功；pEGFP-N1-Anxa3表达质粒构建成功。2.获得单克隆细胞株Hca-Pneo并且证实Anxa3在mRNA和蛋白水平表达上调。Anxa3表达上调能够促进Hca-P细胞侵袭、迁移和体内淋巴结转移，但不明显影响其增殖。
王冰[10]（2011）在《人膜联蛋白A3原核表达及其在哮喘患儿淋巴细胞表达水平研究》文中进行了进一步梳理小儿支气管哮喘是儿童常见的慢性呼吸系统疾病。近年来其发病率在世界范围内呈上升趋势,发达国家儿童哮喘的患病率高达10%以上。由于哮喘常反复发作,难以根治,所以严重影响患儿的身心健康,也给患儿家长带来了沉重的经济负担和精神压力。本实验室研究发现膜联蛋白A3在哮喘大鼠淋巴细胞中表达上调,因此我们推测膜联蛋白A3可能在哮喘病的起因和形成等过程中发挥重要的作用。本研究根据NCBI上报道膜联蛋白A3的序列设计引物,克隆得到膜联蛋白A3基因anx A3,经测序鉴定序列与已报道的完全一致,其ORF为1026bp,编码341个氨基酸。我们利用原核表达载体pEASY成功构建了重组载体pEASY-anx A3,并在大肠杆菌Transetta（DE3） （DE3）中成功表达。利用镍柱亲和层析的原理,成功纯化蛋白ANX A3。利用商业化抗体和Western Blot技术检测鉴定,表达纯化的蛋白为膜联蛋白A3。我们用纯化的蛋白ANX A3免疫兔子,抽取血清,提取并纯化抗体。点印记实验表明我们纯化的抗体可用于ANX A3蛋白的鉴定。利用Western Blot实验,检测了正常儿童和哮喘患儿ANX A3蛋白的表达情况,结果发现在哮喘发作期患儿淋巴细胞中ANX A3的表达上调,进一步证实了ANX A3与小儿哮喘发作相关,ANX A3将来有望成为小儿哮喘的诊断标识分子和治疗的靶点。
二、人膜联蛋白Ⅴ基因的克隆及原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人膜联蛋白Ⅴ基因的克隆及原核表达（论文提纲范文）
（1）药物新适应症的开发 ——抗肠道病毒EV71的功效评价及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肠道病毒 |
| 1.2 肠道病毒 71 型 |
| 1.2.1 EV71基因组结构及编码蛋白产物 |
| 1.2.2 EV71病毒颗粒结构与基因分型 |
| 1.2.3 EV71的物理化学活性 |
| 1.2.4 EV71病毒复制过程及11种蛋白的功能 |
| 1.2.5 EV71病毒感染临床表现及致病机制探讨 |
| 1.2.6 EV71病毒流行现状及预防措施 |
| 1.3 EV71疫苗研究进展 |
| 1.4 EV71药物研究进展 |
| 1.4.1 抑制EV71进入宿主细胞 |
| 1.4.2 抑制EV71功能性蛋白 |
| 1.4.3 抑制 EV71 的复制 |
| 1.4.4 抑制EV71的翻译 |
| 1.5 药物新适应症的开发 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和病毒株 |
| 2.1.2 供试化合物 |
| 2.1.3 实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验仪器及设备 |
| 2.1.5 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 病毒的扩增 |
| 2.2.3 病毒滴度的确定 |
| 2.2.4 FDA批准的1430种化合物抗EV71初筛 |
| 2.2.5 对初筛得到的化合物进行复筛 |
| 2.2.6 化合物对EV71子代病毒产量的影响 |
| 2.2.7 化合物体外对病毒的直接杀伤作用 |
| 2.2.8 不同加药方式对EV71的作用 |
| 2.2.9 不同时间点加入化合物对病毒复制的影响 |
| 2.2.10 化合物对EV71RNA合成的影响 |
| 2.2.11 中量提取去内毒素质粒 |
| 2.2.12 细胞瞬时转染实验 |
| 2.2.13 检测化合物对EV712A蛋白酶活性的影响 |
| 2.2.14 3C蛋白酶重组质粒的构建 |
| 2.2.15 3C蛋白酶的原核表达 |
| 2.2.16 3C蛋白酶的纯化 |
| 2.2.17 检测化合物对EV713C蛋白酶活性的影响 |
| 2.2.18 统计学分析 |
| 第三章 化合物抗EV71功效评价 |
| 3.1 抗EV71活性化合物的筛选 |
| 3.1.1 FDA批准的1430种化合物抗EV71初筛结果 |
| 3.1.2 抗EV71活性化合物的复筛结果 |
| 3.1.3 目标化合物的确定 |
| 3.2 目标化合物对RD细胞的毒性 |
| 3.3 化合物对于EV71引起的CPE及抑制活性 |
| 3.4 活性化合物对EV71子代病毒产量的影响 |
| 3.5 本章总结 |
| 第四章 化合物抗EV71机理研究 |
| 4.1 化合物对病毒的直接杀伤作用 |
| 4.2 化合物抗EV71的作用阶段 |
| 4.3 化合物作用于EV71复制的时期 |
| 4.4 化合物对EV71病毒滴度和RNA合成的影响 |
| 4.5 化合物对EV712A蛋白酶活性的影响 |
| 4.6 化合物对EV713C蛋白酶活性的影响 |
| 4.6.1 重组质粒的鉴定 |
| 4.6.2 3C蛋白酶的体外表达和纯化 |
| 4.6.3 化合物对EV713C蛋白酶活性的影响 |
| 4.7 本章总结 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表或投稿中的学术论文 |
| 缩略词中英文对照表 |
（2）BVDV非结构蛋白Npro介导泛素化降解ELF4的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展 |
| 1.2.1 流行病学 |
| 1.2.2 发病机理 |
| 1.2.3 诊断 |
| 1.2.4 病原学 |
| 1.2.5 BVDV结构与功能 |
| 1.2.6 BVDV引起的免疫反应 |
| 1.3 天然免疫中的泛素化修饰 |
| 1.3.1 泛素化修饰的简介 |
| 1.3.2 泛素化修饰参与调控抗病毒天然免疫 |
| 1.4 转录因子ELF4 |
| 1.4.1 ETS家族的简介 |
| 1.4.2 ELF4的功能 |
| 1.5 热休克蛋白Hsp70 |
| 1.5.1 热休克蛋白Hsp70的简介 |
| 1.5.2 Hsp70系统在病毒生命周期中的功能 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 2 牛病毒性腹泻病毒N~(pro)真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体、细胞和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养与病毒增殖 |
| 2.2.2 病毒及细胞的RNA提取及反转录 |
| 2.2.3 BVDV N~(pro)基因的克隆及分析 |
| 2.2.4 BVDV N~(pro)蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 293T细胞的转染 |
| 2.2.6 重组蛋白pcDNA3.1-N~(pro) Western blot的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BVDV NADL株接种MDBK细胞结果 |
| 2.3.2 N~(pro)基因PCR的扩增 |
| 2.3.3 重组质粒p MD-18T-N~(pro)的鉴定 |
| 2.3.4 BVDV N~(pro)蛋白生物信息学分析 |
| 2.3.5 真核表达产物pcDNA3.1-N~(pro)的鉴定 |
| 2.3.6 重组蛋白pcDNA3.1-N~(pro)的Western blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 BVDV非结构蛋白N~(pro)通过K48位多聚泛素化降解ELF4 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞及质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 蛋白互作的预测 |
| 3.2.2 ELF4泛素化位点的预测 |
| 3.2.3 转化 |
| 3.2.4 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.2.6 免疫共沉淀试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 蛋白互作预测结果 |
| 3.3.2 ELF4泛素化位点的预测及分布 |
| 3.3.3 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.3.4 ELF4蛋白Western blot的鉴定 |
| 3.3.5 通过Co-IP试验分析N~(pro)和ELF4的相互作用 |
| 3.3.6 N~(pro)降解ELF4的K48位多聚泛素化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 筛选BVDV N~(pro)互作蛋白及对ELF4的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 质粒、细胞、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 检测N~(pro)在MDBK细胞中的表达 |
| 4.2.2 BCA试剂盒检测蛋白浓度 |
| 4.2.3 快速银染试验 |
| 4.2.4 免疫共沉淀试验 |
| 4.2.5 牛Hsp70基因引物的设计与合成 |
| 4.2.6 牛Hsp70基因的扩增 |
| 4.2.7 牛Hsp70基因真核表达载体的构建 |
| 4.2.8 磷酸钙沉淀转染 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 N~(pro)质粒在MDBK细胞中的表达情况 |
| 4.3.2 Co-IP中N~(pro)蛋白总量的测定 |
| 4.3.3 Co-IP试验结果 |
| 4.3.4 LC-MS/MS质谱技术鉴定SDS-PAGE胶中的所有蛋白 |
| 4.3.5 候选蛋白分析结果 |
| 4.3.6 牛源Hsp70基因的扩增 |
| 4.3.7 真核表达产物pcDNA3.0-Hsp70双酶切鉴定 |
| 4.3.8 牛源Hsp70质粒的表达 |
| 4.3.9 BVDV N~(pro)蛋白与Hsp70的相互作用 |
| 4.3.10 转染Hsp70质粒对BoELF4蛋白水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（3）Annexin A2单克隆抗体抗肿瘤活性的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料、试剂 |
| 1.2 Annexin A2蛋白单克隆抗体的制备与特异性检测 |
| 1.3 MTT法检测外源性Annexin A2抗体对肿瘤细胞生长的影响 |
| 1.4 流式细胞术检测外源性抗体对肿瘤细胞周期的影响 |
| 1.5 Transwell检测体外细胞的迁移 |
| 1.6 RT-PCR检测外源性抗体加入对肿瘤细胞周期相关基因的影响 |
| 1.7 Quantitative real-time PCR检测外源抗体加入对肿瘤细胞周期相关基因的影响 |
| 1.8 Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK6的表达 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Annexin A2抗体的特异性检测 |
| 2.2 AnnexinA2单克隆抗体对肿瘤细胞生长的影响 |
| 2.3 Transwell检测体外细胞的迁移 |
| 2.4 流式细胞术检测Annexin A2单克隆抗体对肿瘤细胞周期的影响 |
| 2.5 RT-PCR及Quantitative real-time PCR检测 |
| 2.6 Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK6的表达 |
| 3 讨论 |
（4）细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述：单链抗体在肿瘤诊断及治疗中的研究及应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）人膜联蛋白A3的原核表达及纯化（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（7）RKIP的克隆、表达及其影响肿瘤细胞迁移和细胞凋亡检测性质初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 RKIP生物学功能的研究现状 |
| 1.1 RKIP蛋白结构与表达定位 |
| 1.2 RKIP在细胞信号转导通路中的作用 |
| 1.3 RKIP与细胞增殖、分化 |
| 1.4 RKIP与细胞凋亡 |
| 1.5 RKIP与肿瘤转移 |
| 1.6 RKIP的其他生物学功能 |
| 1.7 论文的研究目的和研究内容 |
| 第二章 RKIP蛋白和肿瘤细胞迁移 |
| 2.1 绪论 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 限制性内切酶与工具酶 |
| 2.2.4 层析介质 |
| 2.2.5 其它试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 RKIP相关表达载体的构建 |
| 2.3.2 RKIP蛋白表达 |
| 2.3.3 RKIP蛋白纯化 |
| 2.3.4 SDS-PAGE鉴定纯度 |
| 2.3.5 A549细胞伤口愈合实验 |
| 2.4 实验结果及结论 |
| 2.4.1 PCR鉴定结果 |
| 2.4.2 蛋白鉴定结果 |
| 2.4.3 细胞伤口愈合实验结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 EGFP-RKIP蛋白和细胞凋亡检测 |
| 3.1 绪论 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 细胞株 |
| 3.2.3 限制性内切酶与工具酶 |
| 3.2.4 层析介质 |
| 3.2.5 其它试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 EGEP-PKIP相关表达载体的构建 |
| 3.3.2 EGFP-RKIP的表达 |
| 3.3.3 EGFP-RKIP蛋白纯化 |
| 3.3.4 SDS-PAGE鉴定纯度 |
| 3.3.5 EGFP-RKIP蛋白细胞凋亡检测 |
| 3.4 实验结果及结论 |
| 3.4.1 PCR鉴定结果 |
| 3.4.2 蛋白鉴定结果 |
| 3.4.3 EGFP-RKIP蛋白凋亡功能检测结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 N端和C端结构对其功能和稳定性的影响 |
| 4.1 绪论 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 限制性内切酶与工具酶 |
| 4.2.3 其它试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Seg1和Seg2相关载体的构建 |
| 4.3.2 蛋白的表达 |
| 4.3.3 蛋白SDS-PAGE鉴定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 PCR鉴定结果 |
| 4.4.2 蛋白鉴定结果 |
| 4.4.3 细菌生长曲线结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）棉花（Gossypium hirsutum）膜联蛋白基因克隆鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 膜联蛋白研究进展 |
| 1.1.1 膜联蛋白发现、命名与分类 |
| 1.1.2 膜联蛋白的基本结构和参与相关的生命活动 |
| 1.2 植物膜联蛋白研究进展 |
| 1.2.1 植物膜联蛋白的发现 |
| 1.2.2 植物膜联蛋白家族 |
| 1.2.3 植物膜联蛋白的结构 |
| 1.2.4 植物膜联蛋白在植物体内的表达和亚细胞定位 |
| 1.2.5 植物膜联蛋白基因的表达调控 |
| 1.2.6 植物膜联蛋白的生物学功能 |
| 1.3 立题依据和研究意义 |
| 第二章 棉花AnnGhs基因分离鉴定和蛋白亚细胞定位 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 Annexin基因的cDNA |
| 2.1.3 菌种和质粒 |
| 2.1.4 工具酶 |
| 2.1.5 化学试剂 |
| 2.1.6 常用培养基 |
| 2.1.7 棉花总RNA提取试剂 |
| 2.1.8 PCR扩增引物及试剂 |
| 2.2 实验器材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因及其编码蛋白质序列分析 |
| 2.3.2 棉花AnnGhs基因的组织表达分析 |
| 2.3.3 棉花膜联蛋白亚细胞定位分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 4个棉花AnnGhs基因cDNA的分离和鉴定 |
| 2.4.2 AnnGhs蛋白系统进化分析 |
| 2.4.3 AnnGhs蛋白序列比较及结构分析 |
| 2.4.4 AnnGhs基因在棉花各组织的差异表达分析 |
| 2.4.5 AnnGh蛋白的亚细胞定位 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 棉花膜联蛋白基因在纤维发育中的表达调控 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌种和质粒 |
| 3.1.3 工具酶及试剂盒 |
| 3.1.4 化学试剂 |
| 3.1.5 常用缓冲液及培养基 |
| 3.1.6 棉花总RNA提取试剂 |
| 3.1.7 原位杂交所用试剂 |
| 3.2 实验器材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 棉花培养与棉花纤维各发育时期材料收集 |
| 3.3.2 棉花纤维的各种激素处理 |
| 3.3.3 棉花纤维的钙离子处理 |
| 3.3.4 棉花纤维各发育时期的RNA提取 |
| 3.3.5 实时定量RT-PCR分析 |
| 3.3.6 原位杂交分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 AnnGh基因在纤维发育的表达调控 |
| 3.4.2 不同激素处理对AnnGh基因在纤维中表达的影响 |
| 3.4.3 不同Ca~(2+)浓度对AnnGh基因在纤维中表达的影响 |
| 3.4.4 RNA原位杂交分析AnnGh基因在纤维中的特异表达 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 棉花AnnGh3启动子活性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物实验材料 |
| 4.1.2 菌种和质粒 |
| 4.1.3 常用储存液 |
| 4.1.4 常用缓冲液 |
| 4.1.5 工具酶 |
| 4.1.6 GUS染液配方 |
| 4.1.7 培养基 |
| 4.2 实验器材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 棉花材料的培养与收集 |
| 4.3.2 棉花基因组gDNA的提取 |
| 4.3.3 启动子的分离 |
| 4.3.4 启动子测序与序列分析 |
| 4.3.5 AnnGh3p::GUS融合表达载体的构建 |
| 4.3.6 AnnGh3p::GUS的转化及转基因拟南芥的筛选及GUS染色 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 AnnGh3基因的启动子的分离与序列分析 |
| 4.4.2 AnnGh3p::GUS融合表达载体的构建和阳性植株的鉴定 |
| 4.4.3 AnnGh3基因启动子的表达模式分析 |
| 4.4.4 IAA、H_2O_2和黑暗处理能够增强AnnGh3基因启动子表达活性 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 棉花AnnGh3蛋白与Ca~(2+)的结合活性研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株和载体 |
| 5.1.2 工具酶及试剂盒 |
| 5.1.3 常用储液 |
| 5.1.4 常用缓冲液 |
| 5.1.5 培养基 |
| 5.1.6 其他试剂 |
| 5.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 AnnGh3蛋白序列分析 |
| 5.3.2 pMal-AnnGh3融合表达载体的构建 |
| 5.3.3 AnnGh3蛋白的预表达 |
| 5.3.4 上清蛋白样品的制备 |
| 5.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 5.3.6 纯化MBP-AnnGh3和MBP蛋白 |
| 5.3.7 MBP-AnnGh3融合蛋白与Ca~(2+)结合胶迁移实验 |
| 5.3.8 AnnGh3蛋白与Ca~(2+)结合胶迁移实验 |
| 5.3.9 MBP-AnnGh3融合蛋白加入Ca~(2+)的荧光猝灭实验 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 AnnGh3蛋白序列分析 |
| 5.4.2 重组质粒pMal-AnnGh3载体构建及鉴定 |
| 5.4.3 AnnGh3蛋白的预表达 |
| 5.4.4 MBP-AnnGh3的纯化 |
| 5.4.5 Ca~(2+)结合胶迁移实验 |
| 5.4.6 MBP-AnnGh3蛋白与Ca~(2+)的荧光猝灭实验 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 AnnGh3在转基因拟南芥中的功能研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 菌种和质粒 |
| 6.1.3 工具酶 |
| 6.1.4 常用储存液 |
| 6.1.5 常用缓冲液 |
| 6.1.6 培养基 |
| 6.1.7 拟南芥总RNA提取试剂 |
| 6.1.8 拟南芥gDNA提取试剂 |
| 6.1.9 PCR扩增分析试剂 |
| 6.2 仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 AnnGh3过量表达载体构建 |
| 6.3.2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化 |
| 6.3.3 过量表达AnnGh3转基因拟南芥在基因组水平的鉴定 |
| 6.3.4 过量表达AnnGh3转基因拟南芥在mRNA表达水平的鉴定 |
| 6.3.5 拟南芥莲座叶表皮毛表型观察及数量统计 |
| 6.3.6 拟南芥莲座叶表皮毛长度测量 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 过量表达AnnGh3转基因拟南芥鉴定 |
| 6.4.2 AnnGh3基因对于拟南芥莲座叶表皮毛表型的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 植物树脂半薄切片染色方法的改进 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料 |
| 7.2.1 植物材料 |
| 7.2.2 化学试剂 |
| 7.2.3 培养基 |
| 7.3 实验仪器 |
| 7.4 实验方法 |
| 7.5 实验结果 |
| 7.5.1 植物树脂半薄切片相关方法的改进 |
| 7.5.2 双子叶植物棉花组织的树脂半薄切片观察 |
| 7.5.3 单子叶植物玉米茎树脂半薄切片观察 |
| 7.6 讨论 |
| 结论 |
| 本论文的主要创新点 |
| 参考文献 |
| 氨基酸的中英文名称及简写符号 |
| 缩写词表 |
| 博士期间撰写和发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）Anxa3表达上调对小鼠肝癌Hca-P细胞株生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Anxa3 CDS 克隆载体及真核表达载体构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 pEGFP-N1-Anxa3 稳定转染 Hca-P 细胞及鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 转染 Hca-P 细胞单克隆筛选，鉴定及功能检测 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Anxa3 的生物学特性及其与疾病的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）人膜联蛋白A3原核表达及其在哮喘患儿淋巴细胞表达水平研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 膜联蛋白A3的研究进展 |
| 1.2 原核表达简介 |
| 1.3 多抗的优点及制备原理 |
| 1.4 Western Blot简介 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 结果 |
| 3.2 讨论 |
| 3.3 展望 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 作者简介 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 参加课题 |
| 致谢 |
四、人膜联蛋白Ⅴ基因的克隆及原核表达（论文参考文献）
- [1]药物新适应症的开发 ——抗肠道病毒EV71的功效评价及机理研究[D]. 李妮. 湖北工业大学, 2020(04)
- [2]BVDV非结构蛋白Npro介导泛素化降解ELF4的分子机制研究[D]. 王丽. 黑龙江八一农垦大学, 2020(09)
- [3]Annexin A2单克隆抗体抗肿瘤活性的实验研究[J]. 陈赛,聂纪芹,李聪,谭超. 免疫学杂志, 2019(06)
- [4]细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化[D]. 郭鑫鑫. 新乡医学院, 2017(04)
- [5]人膜联蛋白A3的原核表达及纯化[J]. 王冰,高萍,牛诚诚,李善玉. 中国生物制品学杂志, 2015(04)
- [6]带科绦虫的膜联蛋白研究进展[J]. 卫春晓,李天丽,索延乐. 当代畜禽养殖业, 2015(01)
- [7]RKIP的克隆、表达及其影响肿瘤细胞迁移和细胞凋亡检测性质初步研究[D]. 皮亚洲. 南京大学, 2013(05)
- [8]棉花（Gossypium hirsutum）膜联蛋白基因克隆鉴定及功能研究[D]. 李兵. 华中师范大学, 2012(12)
- [9]Anxa3表达上调对小鼠肝癌Hca-P细胞株生物学行为的影响[D]. 徐康. 大连医科大学, 2012(01)
- [10]人膜联蛋白A3原核表达及其在哮喘患儿淋巴细胞表达水平研究[D]. 王冰. 吉林大学, 2011(09)