一、环境对果蝇P转座因子的作用关系研究（论文文献综述）
王全贵[1]（2021）在《地熊蜂基因组中活跃转座子的鉴定》文中研究表明转座因子（TEs）是真核生物基因组的主要序列成分,对真核生物基因组的结构、功能及进化具有重大影响。活跃的转座子插入到基因的启动子、外显子、内含子以及基因的5’、3’区域,改变或者破坏基因的表达,从而产生突变体。在陆地生态系统中,授粉昆虫发挥着极其重要的作用。特别是蜜蜂,它们是全球农作物主要的授粉昆虫。通过蜜蜂授粉可以明显提高农作物的产量、改善农产品的品质,故具有非凡的农业生产力。熊蜂作为蜜蜂科中的一员,由于其在温室作物传粉中的巨大作用而被人们广泛专注。近年来,虽然有关昆虫转座子的研究在不断增加,且科学家成功地应用转座子进行了功能基因的挖掘,但相关研究主要集中于双翅目的果蝇中,目前熊蜂中尚无高效的功能基因挖掘系统。我们利用生物信息学方法,基于de novo预测和结构预测两种策略,对地熊蜂参考基因组中的转座子进行了详细的鉴定、分类和注释,并鉴定出潜在活跃的转座子。结果显示:虽然转座子序列仅占地熊蜂基因组全部序列的3.74%,但其超家族种类繁多,鉴定出的33282个转座子分属于22个超家族。通过生物信息学方法鉴定出一条具有潜在活性的MITE转座子序列,它很可能正在地熊蜂基因组中发生转座。其次,运用群体基因组学手段去检测这条MITE在群体中的多态性位点情况。结果显示,在同一群体19个雄性熊蜂内,这条MITE有21个多态性位点。多数MITE序列倾向于插入AT区及基因的启动子区。最后,使用同一群体36只雄性蜂对21个多态性位点进行PCR验证,验证出一个多态性条带。该位点位于编码lnc RNA的基因的启动子区。本研究从生物信息学、群体基因组学以及分子生物学实验验证三个层面系统地分析了地熊蜂基因组中转座子的组成、分类并鉴定出潜在活跃的转座子。通过这些分析,我们确定熊蜂基因组中有一个MITE应该是活跃的转座子。本研究鉴定出来的活跃的转座子将为创制地熊蜂的突变体库进而挖掘熊蜂的功能基因奠定了重要的基础。
刘珂珂,汤定钦,周明兵[2]（2021）在《转座子衍生基因的演变途径及对生物生长发育的影响》文中指出转座子（transposable elements,TEs）是指在基因组上能从同一条染色体的一个位置转移到另一个位置或者从一条染色体转移到另一条染色体上的一段DNA 序列。广泛存在于基因组中的转座子通过复制、动员、重组基因片段以及修改原基因结构形成的新基因,被称为转座子衍生基因。该文综述了转座子衍生基因与转座子和常规基因的异同以及转座子衍生基因的演变途径,归纳了转座子衍生基因对宿主基因进化,以及对生物生长发育的影响。
李兰霞[3]（2020）在《全基因组水平研究拟南芥中RNA与染色质的相互作用》文中提出研究表明真核生物的细胞核内存在大量的RNA,其中一些RNA能够结合到特定的染色质位点,招募下游的调控因子,通过对特定染色质区域的组蛋白进行修饰、改变DNA甲基化状态或调节染色质的结构,调控基因表达。因此,确定各RNA分子在染色质上的结合位点,对于探究RNA在细胞核内的功能具有重要意义。GRID-seq（Global RNA interactions with DNA by deep sequencing）是一个系统性捕捉细胞核内RNA与染色质相互作用的新兴技术。在本论文中,我们运用该技术对拟南芥幼苗进行GRID-seq文库构建,并对核内RNA在染色质上的结合位点进行了系统性分析。我们共鉴定到40,737对RNA-染色质相互作用,这些相互作用中的RNA包括来源于蛋白编码基因的RNA转录本、长链非编码RNA和小RNA。其中,来源于蛋白编码基因的RNA转录本主要介导了局部相互作用（local interaction）,而长链非编码RNA和小RNA则更偏向于发生远距离相互作用,包括顺式染色体相互作用（cis-chromosome interaction）和反式染色体相互作用（trans-chromosome interaction）。绝大多数RNA分子只是介导数量有限的几对相互作用,但还有一小部分RNA分子可介导成百上千对相互作用。此外,我们还发现一些RNA-染色质相互作用能够受到生物胁迫、非生物胁迫以及激素刺激诱导而发生特异性变化,并且发现同一调控通路中的基因间形成丰富的RNA-染色质相互作用,形成RNA-染色质互作网络。综上所述,本研究利用高通量技术,系统地分析了拟南芥中的RNA-染色质相互作用,提出了蛋白编码基因来源的RNA（protein-coding RNA）在细胞核内可能还具有独立于蛋白编码以外的调节功能。此外,本研究还提出了细胞核内可能存在着一系列RNA-染色质互作网络,帮助植物来应对特定的环境刺激,这对于理解植物逆境响应机制提供了新思路。
史美娟[4]（2020）在《转基因家蚕后部丝腺表达丝胶蛋白SER3对血淋巴黑化免疫的影响》文中研究表明利用基因编辑技术改性蚕丝,以及利用家蚕丝腺生物反应器高效生产外源功能蛋白,是养蚕业的重大课题。迄今为止,大量试图直接将编码优良特色丝蛋白纤维的基因导入家蚕的尝试,以及利用丝腺生物反应器生产功能性蛋白质的转基因家蚕,普遍遇到了丝腺发育不良、生殖能力下降、个体生命力低下、外源蛋白质表达水平低等瓶颈问题。利用合适的转基因家蚕模型,研究外源基因表达对家蚕代谢、免疫系统等的影响,对探讨解决上述瓶颈问题具有重要意义。本文利用后部丝腺表达了中部丝腺特异表达的丝胶蛋白SER3的转基因家蚕突变体纯系SER（Ser3+/+）为模型开展研究,突变体SER很好地避免了组织和个体生长发育异常问题,茧丝生产能力甚至超过野生型,但与先天免疫相关的血淋巴黑化能力发生了显着变化。本文深入研究了 SER血淋巴黑化能力变化的机制,探讨了转基因对家蚕黑化免疫及个体抗逆的影响,以期为转基因家蚕安全评估在分子层面提供参考。主要研究结果如下:（1）转基因家蚕后部丝腺表达Ser3,通过抑制酚氧化酶原的表达和活化,提高血淋巴的抗氧化水平,介导血淋巴黑化免疫能力下降。转基因突变体SER 5龄幼虫血淋巴中的酚氧化酶（PO）活性显着降低,导致与先天免疫相关的黑化能力显着变差。首先调查调控黑色素合成的丝氨酸蛋白酶生化通路发现,在5L3d,负调控PO活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂Spn5、Spn6、Spn32,在其来源组织脂肪体中的基因转录水平分别比野生型家蚕上调了 4.24倍、479.36倍和67.84倍,导致血淋巴对蛋白酶K的抑制活性显着增强,进一步抑制了丝氨酸蛋白酶（HP21、PPAE）对酚氧化酶原（PPO）的活性剪切,导致血淋巴中的PO活性降低。表明后部丝腺表达Ser3抑制了 PPO活性剪切。其次,调查血淋巴调控PPO基因表达的转录因子Bmlozenge发现,在5L1d、W期,Bmlozenge在SER家蚕的转录水平比野生型分别上调了 1.37倍、5.13倍,但PPO1、PPO2转录水平却呈极显着低水平表达。提示后部丝腺表达Ser3影响了 PPO的转录调控。最后,调查血淋巴抗氧化代谢发现,在摇摆期,突变体SER血淋巴过氧化氢酶（CAT）和两种超氧化物歧化酶亚型（Cu-SOD、Mn-SOD）基因转录水平上调了 2.47倍、3.10倍和1.20倍,血淋巴CAT活性增加了 3.47倍,诱导血淋巴总抗氧化能力（T-AOC）和抑制超氧阴离子能力（ASAFR）分别升高了 1.13倍和1.34倍,过氧化氢含量降低了 52.4%。表明后部丝腺表达Ser3影响了血淋巴氧化还原代谢,提高了抗氧化能力。（2）转基因家蚕后部丝腺表达Ser3,诱导体液免疫响应,改变个体病菌抵抗力。5龄幼虫血淋巴注射染菌,突变体的生存率显着高于野生型。感染革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性菌S.aureus后,野生型全部在幼虫期死亡,突变体能够发育至吐丝结茧的幼虫存活率分别为16.7%和10%。进一步调查SER家蚕参与先天免疫应答的抗菌肽（AMPs）水平,SER幼虫血淋巴AMPs主要来源组织脂肪体中,Moricin,CecropinA,Lebocin,Attacin转录水平显着升高,并且有伴随幼虫丝蛋白质合成速度增加而升高的趋势,在幼虫丝蛋白质合成最旺盛的5L3d,分别比野生型上调了 91.21倍、137.86倍、190.42倍、85.77倍。结论:转基因家蚕突变体后部丝腺表达中部丝腺特异表达的丝胶蛋白SER3,抑制了血淋巴黑色素的合成代谢,导致血淋巴黑化免疫能力下降;诱导上调了血淋巴的氧化应激基础响应水平;通过上调参与体液免疫应答的AMPs水平,增强了抵抗细菌侵染能力。
李朝惠[5]（2019）在《Ttk维持肠祖细胞分化机制及Hbs1对精子发生影响的研究》文中进行了进一步梳理成体组织器官中细胞的日常更新和组织的修复离不开成体干细胞,成体干细胞的自我更新或分化调控的紊乱会破坏组织器官的稳态和正常生理功能,导致许多重要疾病,如癌症和不孕不育症等的发生。果蝇的消化系统和生殖系统与哺乳动物相应系统具有高度保守性,果蝇中肠道干细胞和生殖干细胞的发现,为研究成体干细胞的自我更新和分化调控提供了良好的平台。成体干细胞的分化是一个需要多种信号通路、转录因子和转录后调控因子等多层次调控方式参与的过程。之前的研究表明Tramtrack（Ttk）作为一个转录抑制因子可以抑制肠道祖细胞向肠内分泌细胞（ee）的分化,对于肠道祖细胞的命运决定至关重要,然而ttk功能的缺失除了引起ee细胞的增多还会导致肠道干细胞的异常增生,ttk在肠道中的作用和作用机制仍有待进一步研究;Hbs1是RNA监视复合物Hbs1/Pelo的核心蛋白,参与转录后调控。虽然该复合物在真核生物中高度保守,但其在多细胞生物中的具体生物学作用尚不十分清楚。在本论文肠道的研究中我们发现:在肠道祖细胞中敲低ttk会导致异常表达神经特异性基因的肿瘤形成,其中神经特异的Notch靶标基因dpn的异常表达是肿瘤细胞形成的主要原因;但Ttk在肠道中并不是直接结合抑制dpn表达,进一步的研究表明ttk敲低后神经特异性基因sequoia（seq）的异常表达是导致dpn和其他神经特异性Notch靶基因上调和引起肿瘤的主要原因;Seq可以直接结合到这些神经特异的Notch靶位点,增强Notch通路的转录因子Su（H）在这些位点的结合;另外,seq敲低可以抑制ttk敲低后ee的增加,Seq可以直接结合到sc和ase位点,促进sc和ase的表达进而诱导ee分化,所以Seq也是ttk抑制ee分化的关键因子。在Hbs1功能的研究中我们发现:Hbs1突变会导致精子发生过程中的减数分裂和精子形成阶段异常,最终导致雄性不育。Hbs1与Pelo除了存在体外的相互作用还存在遗传上的相互作用和体内的共定位,Pelo中Hbs1结合位点的缺失也会导致精子发生的异常。因此Hbs1很有可能通过与Pelo形成复合体发挥作用。综上所述,本研究首次报道了肠道祖细胞需要ttk抑制神经特异性基因的表达从而维持正常分化。另外,我们首次报道了Hbs1在果蝇精子发生中的功能,探讨了其作用机制。本研究为更好的理解肠道干细胞分化、ttk的功能和作用机制、精子发生和Hbs1的生物学功能提供线索。
王瑶[6]（2019）在《家蚕BmPSI及其互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx的调控研究》文中研究说明家蚕是鳞翅目昆虫模式生物,其雌雄个体经济价值差异明显,因此对家蚕性别决定的研究不仅可为鳞翅目害虫防治提供参考,而且在养蚕业方面具有产业应用价值。先前研究发现位于家蚕性别决定信号通路下游的Bmdsx基因是家蚕性别分化开关基因,Bmdsx的不同选择性剪接形式决定了家蚕个体性别分化的方向。BmPSI（Byxbom mori P-element somatic inhibitor）蛋白可以特异地结合上Bmdsx pre-mRNA的第4外显子CE1元件,促进Bmdsx的雄性特异性剪接。当敲除BmPSI基因后,转基因家蚕个体中许多性别调控关键基因出现表达紊乱,下游最关键的Bmdsx的剪切形式出现变化,雄性个体中出现Bmdsx雌性剪接形式。另外,先前研究者曾构建家蚕酵母双杂交早期胚胎cDNA文库,并以BmPSI为诱饵筛选文库,发现了与BmPSI结合的剪接体蛋白——BmSPX,我们推测BmSPX可能参与家蚕Bmdsx的选择性剪切过程。为研究PSI调控dsx在昆虫物种间的保守性以及BmPSI互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx选择性剪切的调控作用,我们设计实验方案,获得以下研究结果:1.BmPSI结构域与Bmdsx pre-mRNA的结合活性研究BmPSI蛋白包含4个KH1结构域,该类结构域为RNA结合结构域,本研究构建分别删除其中1个KH1结构域的截短蛋白表达载体,纯化这4种截短蛋白,将4种截短蛋白和全长BmPSI蛋白分别与CE1 RNA探针进行EMSA结合实验。结果显示,4个截短蛋白对CE1结合能力都减弱,其中删除了第一个和第二个KH1结构域的2个截短蛋白与CE1结合能力最弱,这表明家蚕BmPSI蛋白结合CE1的能力由4个KH1结构域共同提供,其中前面两个KH1结构域起主要作用。2.BmPSI蛋白结合CE1关键氨基酸位点的发现及验证将4个KH1结构域氨基酸序列进行多序列比对,根据前两个KH1中保守氨基酸位点筛选影响BmPSI结合CE1探针的潜在关键氨基酸位点。同时基于先前文献报道,KH1活性主要受内部保守锌肽重复序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile（IGGI）影响,本研究对BmPSI结合RNA能力的7个潜在关键氨基酸位点分别进行突变,过量表达并纯化这7种突变的全长BmPSI蛋白。将突变蛋白和CE1序列的RNA探针分别进行EMSA实验,结果发现其中I116G、L127G和mut IGGI这三种突变蛋白的结合能力明显减弱,利用EMSA冷竞争实验证实结合特异。利用圆二色光谱技术检测突变蛋白二级结构,结果显示三种突变蛋白与野生型BmPSI蛋白相比无明显结构差异,同时采用ITC（等温滴定量热法）对突变蛋白与CE1探针的结合亲和常数进行测定,结果发现这三种突变的引入都使BmPSI蛋白结合CE1探针的能力显着减弱。3.PSI结合dsx pre-mRNA在斜纹夜蛾中的保守性研究为研究PSI蛋白与CE1调控元件结合在鳞翅目昆虫中的保守性,本研究开展了家蚕以外的鳞翅目昆虫的PSI蛋白研究。基于斜纹夜蛾基因组计划已经完成,本研究分析了斜纹夜蛾基因组中双性基因（Sldsx）的序列信息,结果显示Sldsx的CE1元件序列与家蚕中序列完全相同。然后,对斜纹夜蛾SlPSI基因进行克隆,构建表达载体并纯化该蛋白。将SlPSI蛋白与CE1探针进行EMSA结合实验,结果显示SlPSI蛋白与CE1探针结合。根据家蚕BmPSI突变位点信息,对SlPSI相同氨基酸位点进行突变,后利用EMSA实验比较突变蛋白与CE1探针的结合能力,结果发现其中I116和IGGI两种位点对SlPSI蛋白结合RNA的能力具有重要的影响,而L127位点的突变对SlPSI结合CE1能力无明显影响。本研究结果表明PSI蛋白与dsx pre-mRNA中CE1元件的结合在鳞翅目昆虫中具有一定的保守性。4.家蚕BmPSI结合蛋白BmSPX的功能研究先前研究表明家蚕性别决定关键蛋白BmPSI可与剪切体蛋白BmSPX结合,为进行BmSPX的功能研究,本实验首先利用piggyBac转基因增量表达载体构建piggyBac-BmSPX重组载体,通过胚胎显微注射获得家蚕BmSPX增量表达品系Over-BmSPX,通过多代连续饲养及荧光筛选获得稳定携带红色荧光的转基因品系。提取转基因个体基因组,对转基因插入情况进行检测,发现BmSPX插入位点在第11号染色体基因间区。通过转基因个体cDNA实时荧光定量PCR检测,发现在转基因雄性个体中,BmSPX表达量上调了约30倍;而在雌性转基因个体中,BmSPX表达量上调了约4倍。综上结果可知,我们获得了稳定遗传的转基因BmSPX增量表达品系。对发育至蛾期的转基因增量表达BmSPX家蚕进行表型观察,同时观察到内生殖器和外生殖器的发育紊乱现象。因此我们推断BmSPX基因在雌、雄家蚕性别分化过程中均发挥重要作用。为研究BmSPX在家蚕性别决定中的生理功能,我们对Over-BmSPX转基因品系进行分子水平检测,检测到伴随BmSPX基因表达的明显上调,BmMasc、BmIMP和Bmdsx-F等基因表达量发生明显变化。同时,将BmSPX基因克隆到pSL1180过表达载体中,利用家蚕BmE细胞对家蚕BmSPX和BmPSI两种蛋白进行CO-IP（免疫共沉淀）实验,证实两者在家蚕细胞环境下存在相互作用。利用家蚕胚胎细胞系BmE细胞进行亚细胞定位,发现BmSPX蛋白属于核质穿梭蛋白。由于BmSPX具有精巢组织特异表达的性质,这与家蚕性别决定关键基因BmMasc精巢特异高量表达的情况一致,因此,我们利用CO-IP实验证明:BmSPX蛋白确实与BmMasc蛋白存在相互作用关系。结合转基因品系Over-BmSPX检测及以上其他实验结果,我们推断BmSPX蛋白作为Bmdsx雄特异性剪切阻遏复合体中的蛋白组分参与Bmdsx的选择性剪切。同时,BmSPX蛋白表达量的积累能够造成家蚕性别决定级联网络的调控变化,引起上游BmMasc、BmIMP的表达上调进而促进Bmdsx的雄特异性剪切,进而促进家蚕个体的雄性化发育。综上所述,本论文对家蚕性别决定关键蛋白BmPSI参与Bmdsx选择性剪接的关键氨基酸位点进行鉴定,首次发现除保守锌肽重复序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile外对KH1结构域结合RNA能力具有显着调控作用的关键氨基酸位点I116,并发现PSI蛋白对双性基因dsx pre-mRNA关键元件CE1的结合在鳞翅目昆虫中具有一定保守性;通过多种分子手段证明可与BmPSI结合的家蚕剪接体蛋白BmSPX在家蚕性别决定中具有重要作用,使得家蚕性别决定级联调控进一步完善。
王睿龙[7]（2019）在《PFBC致病基因XPR1果蝇同源基因CG10483功能初探》文中研究说明原发型家族大脑钙化（Primary familial brain calcification,PFBC）是一种少见的神经系统显性遗传疾病,病变多发生于常染色体上。其特征为在大脑基底节部分出现钙化症状,这种疾病在临床上的表现有多种,包括帕金森症,痴呆和认知紊乱等。目前已发现五个PFBC致病基因。其中SLC20A2、PDGFRB、PDGFB发现时间较早已有多个课题组对其进行过研究,而XPR1和ISG15的功能与作用还处于探索阶段。本课题主要专注于对XPR1基因的功能研究。XPR1编码的蛋白是一种逆转录病毒受体,其最先发现于小鼠研究中。目前已知XPR1编码的蛋白是由696个氨基酸组合而成,此蛋白多重跨膜,在后续的研究中发现此蛋白在细胞内控制着磷酸盐的输出,这是在人类中发现的唯一具有磷输出功能的蛋白。而在生物信息学的预测中,此蛋白的两端都位于细胞内,有两个重要的结构域分别为SPX和EXS。其中SPX结构域较为保守,在许多真核生物的蛋白质中都有发现,并且Legati等在PFBC患者中发现的XPR1基因突变大部分都位于此结构域中。果蝇在生物学研究中有着广泛的应用,由于其基因组有将近百分之五十的基因与哺乳动物存在同源基因,同时其有着体积小,遗传背景清楚,繁殖快等优势,因此果蝇常被用作生物模型以研究人类相关基因的功能机制。在果蝇体内CG10483（dXPR1）作为XPR1同源基因,其与XPR1基因的相似性有55%之多,这种相似度在生物学中已足以作为模式生物来研究此基因。在初期实验中我们利用d XPR1的RNAi与UAS-dXPR1果蝇做了初步试验,发现在三龄幼虫大脑中敲减dXPR1（RNAi）钙离子含量较野生型明显减少而UAS-dXPR1的结果则相反,进而我们利用GCa Mp技术进行了初步的RNAi筛选得到了两个可能与dXPR1相关的基因。目前已报道了六个XPR1致病的突变位点,在研究中我们选择有代表性的三个XPR1突变位点来研究其功能。本课题利用P因子插入和位点专一性重组的方法构建了三株在果蝇二号染色体上插入了外源点突变基因的品系果蝇。同时本课题用CRISPR/Cas9系统,设计了两条sgRNA注射入表达Cas酶的果蝇卵中,得到将dXPR1基因片段大部分缺失的突变体果蝇d XPR1-,并初步检测了其表型。本实验构建的四株转基因果蝇品系,将会为进一步探究dXPR1机制与突变位点功能提供基础。
黄宇萍[8]（2017）在《CRISPR/Cas9系统介导的小菜蛾（Plutella xylostella）基因编辑》文中研究表明小菜蛾Plutella xylostella（L.）是重要的世界性农业害虫,主要危害十字花科蔬菜。该虫世代周期短、重叠严重,基因组杂合度高,在高强度的杀虫剂选择压力下,抗药性发展迅速,防治愈发困难。自基因组破译以来,由于缺乏高效的遗传操作平台,小菜蛾的遗传研究进展缓慢。由于其灵活性与适应性,CRISPR/Cas9技术已在功能基因组学、转基因生物构建、转录调控以及基因治疗等研究领域发挥巨大作用,成为基因组编辑的主导技术。在小菜蛾中建立基于CRISPR/Cas9系统的高效遗传操作技术体系,可应用于其基因功能研究乃至种群的遗传调控。因此,结合已有的资源（基因组数据）优势,本论文基于CRISPR/Cas9技术在小菜蛾中进行了相关研究,获得以下成果:1.率先在小菜蛾中应用CRISPR/Cas9技术实现内源基因Pxabd-A的敲除。Pxabd-A在小菜蛾中存在不同的剪切体（isoform A与isoformB）,其序列仅在Ⅱ号外显子上存在五个氨基酸（DFPFP）的差异。表达谱分析表明,Pxabd-A在生长发育的各个时期均有表达,以蛹期表达量最高。通过直接注射体外转录的Cas9 mRNA和基因特异性sgRNA的方法对Pxabd-A进行编辑,可介导目标位点的插入与缺失突变,且G0代的嵌合体突变率达90%。嵌合体幼虫呈现腹节及腹足发育畸形,成虫表现为生殖器发育缺陷。该实验利用CRISPR/Cas9系统可获得生殖系基因敲除的小菜蛾,且Pxabd-A缺失的表型和基因变异均可稳定遗传至下一代,同时解析了该基因在小菜蛾腹节与生殖器发育过程中的重要作用。2.利用CRISPR/Cas9系统对小菜蛾内源基因PxAntp与PxUbx进行编辑,验证该系统在小菜蛾中进行基因编辑的普遍性。直接注射体外转录的Cas9 mRNA与sgRNA靶向基因（PxAntp与PxUbx）,可成功介导靶基因的定点编辑,呈现相应的突变表型:PxAntp突变后的幼虫,其T1、T2胸节发育异常,T2具有T1胸节的某些特征,进而影响蛹的形态和成虫翅的发育;在突变的PxUbx幼虫中,其T1-3胸节的界限被打破,皱缩或扭曲,影响成虫翅的发育。畸形个体的突变检测显示在靶点序列附近存在不同形式的插入或缺失突变。这些结果证明了 CRISPR/Cas9系统可对小菜蛾内源基因PxAntp与PxUbx进行编辑,诱导表型效应。在一定程度上,该系统可替代目前在鳞翅目中广泛应用但效率较低的RNAi策略,用于基因的功能分析。3.鉴定小菜蛾内源的U6启动子并用于小RNA的表达。本实验鉴定了 6个PxU6启动子（PxU6:1-6）,均含有Pol Ⅲ型启动子的基本特征元件:PSEA和TATA box。在小菜蛾细胞系中,不同的PxU6启动子均可驱动shRNA表达,介导EGFP的沉默。其中PxU6:3启动子驱动表达的效率最强。基于PxU6启动子的shRNA表达质粒可以用于细胞系内的shRNA的筛选及全基因组建库。4.U6:sgRNA表达质粒参与介导小菜蛾细胞（in vitro）与个体（in vivo）水平的基因定点编辑。将PxU6:3:sgRNA与Cas9表达质粒直接转染细胞,可高效介导小菜蛾细胞系中EGFP敲除。此外,PxU6:3启动子可在小菜蛾体内驱动sgRNA的表达以指导Cas9蛋白完成对Pxabd-A靶点序列的切割,介导基因突变从而诱发可稳定遗传的表型。内源性的U6启动子高效驱动sgRNA在细胞系和体内转录,可为细胞系中进行全基因组的sgRNA筛选以及转基因CRISPR/Cas9在小菜蛾中的建立奠定基础。5.tRNA-gRNA表达策略的应用及CRISPR衍生的gene drive系统的构建。利用果蝇和水稻的tRNAGly来构建PxU6:3:tRNA:sgRNA-abd-A表达质粒,注射该表达质粒至小菜蛾胚胎中,sgRNA可被转录释放并指导Cas9蛋白靶向Pxabd-A,引起靶点突变,产生的表型与注射体外转录的sgRNA所介导的一致。在小菜蛾中应用tRNA-sgRNA表达策略,可打破靶点和启动子的限制,使得CRISPR多位点编辑更为便利,并为可调控的CRISPR/Cas9系统在小菜蛾中的应用奠定基础。此外,实验通过鉴定的PxU6:3启动子驱动sgRNA靶向Px016319,尝试着在小菜蛾内构建基于CRISPR的gene drive系统,为隐性基因功能的研究及害虫遗传调控策略的建立奠定基础。综上所述,本研究初步建立了适用于小菜蛾的基因组编辑技术平台。首次利用CRISPR/Cas9系统对非模式昆虫小菜蛾的内源基因进行编辑,获得稳定突变品系;鉴定了物种特异性的内源PxU6启动子,在细胞系和小菜蛾体内驱动小RNA的表达介导基因沉默或敲除。鉴定的PxU6启动子为转基因CRISPR/Cas9以及gene drive系统在小菜蛾中的构建与应用奠定了基础,将促进小菜蛾基因功能研究及种群调控的研究。
张洋[9]（2016）在《多梳蛋白抑制复合体1对内源性反转录病毒MLV的靶向机制》文中研究表明内源性反转录病毒（ERV）是嵌在宿主细胞基因组的一类反转录元件,其在宿主胚胎干细胞及生殖细胞中残存的转录及反转座活性对于宿主基因组的保真性和稳定性造成了相当大的威胁。为了抵御ERV的伤害,高等真核生物除了在DNA水平上对其进行突变失活,还在表观遗传水平上对于MLV进行广泛多样的转录抑制。多梳蛋白家族（PcG）是一类通过修饰和改变染色质构象来调控基因转录的表观调控元件,通常以多梳抑制复合体（PRC1/2）的形式作用。近年来发现PcG参与调控ERV的转录抑制,PRC1与PRC2在此过程中是功能互补的,但具体的作用机理尤其是PRC1是如何独立于PRC2被募集至ERV的尚不清楚。本论文着重以ERV的一种类型—小鼠白血病病毒（MLV）为研究对象,通过生物信息学及分子生物学相关技术手段系统比较MLV不同个体拷贝对于招募PRC1能力的差异,寻找MLV中可能作为PRC1招募信号的顺式作用元件,进而揭示PRC1复合体识别并抑制MLV的分子机制。实验方法:（1）将C57BL/6小鼠品系的基因组序列作为参考基因组通过BLAT方法找到全部MLV独立拷贝的具体序列及插入位置的信息。（2）采用序列分析软件DNA STAR考察MLV在该基因组中的每个独立插入拷贝的序列完整性并将其含有大片段缺失的MLV进一步进行分类。（3）通过病毒载体系统构建一系列可诱导表达外源PRC1组分CBX7的稳转细胞系（不同遗传背景的胚胎干细胞系及畸胎瘤细胞）,并验证该细胞系的相关生物学特性。（4）根据MLV的序列组成特点,设计特异性引物在不同遗传背景的小鼠细胞系中对MLV个体拷贝的插入位点进行Genotyping。（5）在不同遗传背景下对PRC1在不同MLV拷贝序列上的富集情况进行ChIP检测。（6）比较PRC1在不同MLV拷贝上富集程度的差异,将检测到能够高效募集PRC1的MLV拷贝进一步进行序列分析,总结序列组成的规律性。实验结果:（1）C57BL/6小鼠品系的基因组中存在73个拷贝的MLV的插入,它们整合在不同的染色体上。（2）存在序列组成相对完整及不同大片段缺失的MLV拷贝,根据缺失片段的具体位置将其分类。（3）成功构建了一系列不同遗传背景的、表达融合荧光蛋白的PRC1核心组分CBX7的稳转细胞系。（4）对不同遗传背景下的小鼠基因组中MLV的插入位置进行了系统的Genotyping,建立了每种细胞的MLV插入信息谱图。（5）ChIP-qPCR结果显示PRC1对于MLV不同拷贝的募集具有选择性,尤其对于一部分序列有缺失的MLV拷贝呈现高富集。（6）进一步研究发现MLV的序列本身对于招募PRC1是必需的,对特异性高募集PRC1的不同MLV拷贝的序列进行分析,逐步找到可能存在的招募PRC1的信号序列。
吴寒宇[10]（2016）在《用于构建突变体库的piggyBac转座子和转座酶转基因鸡的制备》文中提出piggyBac转座子来源于粉纹夜蛾基因组。该转座子转座效率高、载体承载容量大,不存在转座酶过量抑制现象和“localhopping”表征。目前作为一种高效的遗传修饰工具,它已被广泛用于真菌、原生动物、植物及脊椎动物的转基因研究和遗传突变领域中。基因捕获是一种有效的研究基因功能的技术手段。该技术利用报告基因随机插入到基因组造成内源基因失活,并通过报告基因的表达激活揭示基因表达特点,可以高效且随机突变功能基因,建立随机插入的突变体文库。转座子介导的基因捕获有利于实现全基因组范围的插入突变,目前这一技术已被应用到果蝇、斑马鱼及小鼠等转基因研究中,用于制备突变体,发现一些在体内表达或不表达的新功能基因。鸡在人类的生产生活及科学研究中具有重要作用。它属于卵生动物,发育模式特殊,胚胎发育分体内和体外两个阶段。新生种蛋中的鸡胚已经拥有约60000个细胞,利用传统的转基因技术制备转基因鸡比较困难。本研究通过向鸡胚胚盘下腔分别注射piggyBac转座子系统和独立表达转座酶的慢病毒载体,感染位于胚盘下腔的原始生殖细胞,以此制备具有基因抓捕功能的piggyBac转座子转基因鸡和转座酶转基因鸡。本研究将piggyBac转座子载体（pPB-IRES-GFPneo或pZGs）和转座酶载体（pCAG4BP）以2:1的比例混合注射到胚盘下腔,电击鸡胚使两个质粒共同转染入细胞,经Perry三期培养法,制备G0代转座子嵌合体鸡。对其后代心、肝、性腺组织进行PCR检测发现,转座子成功整合到鸡的基因组上,各组织嵌合度不同。筛选到G0代性腺嵌合的公鸡共5只,传代筛选G1代转基因鸡。共检测435只小鸡,阳性个体8只,阳性率为1.8%。Southern Blot实验显示转座子均为单拷贝插入。Genome walking检测G1代转座子鸡A13外源基因插入基因间区,抓捕载体未能捕获到内源基因,报告基因没有表达。针对转座酶转基因鸡的制备,本实验构建了能独立表达转座酶的慢病毒载体,利用包装的慢病毒侵染鸡胚胚盘下腔细胞,制备G0代转座酶嵌合体鸡。共注射185枚种蛋,出雏55只小鸡,孵化率为29.7%。对G0代转座酶嵌合体鸡的全胚组织及弱雏心、肝、性腺组织的PCR检测表明外源基因在各组织嵌合率不同。对筛选到的1只性腺嵌合体公鸡传代,检测了 500只雏鸡转座酶的插入情况,其中阳性后代有2只,Southern Blot实验显示外源基因均为单拷贝插入。Genome walking检测到两只转基因鸡插入位点位于不同基因的内含子区。本研究成功制备了具有基因抓捕功能的piggyBac转座子转基因鸡和转座酶转基因鸡,为后续实验提供研究基础。待两种鸡性成熟后进行交配,利用转座酶可诱导转座子变更插入位置的特点,筛选带有新整合位点的转座子后代,建立鸡群突变体库,为研究和发现已知基因的未知功能及未知基因的新功能提供理论基础和实验对象。
二、环境对果蝇P转座因子的作用关系研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、环境对果蝇P转座因子的作用关系研究（论文提纲范文）
（1）地熊蜂基因组中活跃转座子的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 转座子概述 |
| 1.1.1 转座子及其分类 |
| 1.1.2 转座子与基因组进化 |
| 1.2 MITE转座子的研究概述 |
| 1.2.1 MITE及其结构特征 |
| 1.2.2 MITE的研究现状 |
| 1.3 转座子诱变 |
| 1.4 熊蜂是重要的传粉昆虫 |
| 1.5 本研究的内容及意义 |
| 第二章 地熊蜂基因组中具有潜在活性的转座子的鉴定及进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据来源 |
| 2.1.2 所用软件 |
| 2.1.3 转座子数据库的构建 |
| 2.1.4 基因组转座子注释 |
| 2.1.5 转座子间序列差异分析 |
| 2.1.6 潜在活性转座子的鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 地熊蜂基因组转座子鉴定结果 |
| 2.2.2 转座子年龄分布分析结果 |
| 2.2.3 潜在的活跃转座子 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 活跃的转座子的鉴定 |
| 3.1 利用群体基因组学鉴定活跃的转座子 |
| 3.1.1 数据来源 |
| 3.1.2 测序数据的质控和比对 |
| 3.1.3 寻找插入多态性位点 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 软件运行结果 |
| 3.2.2 鉴定出的转座子活性位点 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 活性转座子的验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 使用软件 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 DNA提取 |
| 4.2.2 PCR扩增 |
| 4.2.3 目的基因的回收与纯化 |
| 4.2.4 序列测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PCR扩增目的基因片段结果 |
| 4.3.2 测序序列比对结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）转座子衍生基因的演变途径及对生物生长发育的影响（论文提纲范文）
| 1 转座子衍生基因与转座子和常规基因的异同 |
| 2 转座子衍生基因演变途径 |
| 2.1 转座子插入 |
| 2.2 形成嵌合基因 |
| 2.3 分子驯化 |
| 3 转座子衍生基因对生物生长发育的影响 |
| 4 结论与展望 |
（3）全基因组水平研究拟南芥中RNA与染色质的相互作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 选题背景及意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 核酸的发现 |
| 1.2.2 RNA的种类 |
| 1.2.3 染色质相关RNA |
| 1.2.4 染色质相关RNA的功能 |
| 1.2.5 植物中染色质相关RNA的功能 |
| 1.2.6 RNA-染色质相互作用的检测方法 |
| 1.2.7 病原菌诱导的植物响应机制 |
| 1.2.8 热刺激响应通路 |
| 1.2.9 生长素信号通路 |
| 1.2.10 DNA双链断裂修复的研究现状 |
| 1.2.11 组蛋白修饰在DNA损伤修复中的调节功能 |
| 1.2.12 组蛋白甲基转移酶在植物中的研究现状 |
| 1.3 论文研究方法 |
| 1.4 论文结构 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 植物培养所需材料 |
| 2.1.3 酶和试剂 |
| 2.1.4 菌种 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物培养 |
| 2.3.2 植物材料的处理 |
| 2.3.3 植物材料的固定 |
| 2.3.4 植物细胞核的提取 |
| 2.3.5 构建GRID-seq文库 |
| 2.3.6 GRID-seq数据分析 |
| 2.3.7 GRID-seq相互作用热图的构建 |
| 2.3.8 GRID-seq相互作用三元图的构建 |
| 2.3.9 基因组相互作用的可视化 |
| 2.3.10 各处理前后RNA-染色质相互作用的差异性变化分析 |
| 2.3.11 各处理前后RNA-染色质相互作用的富集分析 |
| 2.3.12 刺激信号通路中RNA-染色质相互作用变化的动态网络图 |
| 2.3.13 构建RNA-seq文库 |
| 2.3.14 RNA-seq数据分析 |
| 2.3.15 比较GRID-seq与RNA-seq中RNA丰度的相关性 |
| 2.3.16 ChIRP-qPCR |
| 2.3.17 拟南芥中DSB修复效率的检测 |
| 2.3.18 Northern blot检测 |
| 第3章 拟南芥幼苗的GRID-seq文库制备与质量检测 |
| 3.1 在拟南芥中建立GRID-seq文库构建体系 |
| 3.1.1 优化植物细胞核的提取方法 |
| 3.1.2 优化促进染色体开放的SDS浓度 |
| 3.1.3 拟南芥幼苗的GRID-seq文库制备与质量控制 |
| 3.2 拟南芥幼苗的GRID-seq文库数据的分析和质量控制 |
| 3.2.1 拟南芥幼苗的GRID-seq文库数据的质量控制 |
| 3.2.2 拟南芥幼苗的GRID-seq文库数据与转录数据的相互比较 |
| 3.2.3 拟南芥幼苗的GRID-seq文库数据背景归一化 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 拟南芥中RNA-染色质相互作用的基本特征 |
| 4.1 拟南芥中GRID-seq文库捕获的RNA,DNA读段在基因组上的分布特征 |
| 4.2 拟南芥中RNA与染色质的相互作用 |
| 4.2.1 鉴定拟南芥中的RNA-染色质相互作用对 |
| 4.2.2 介导不同互作类型的RNA和 DNA均具有不同的基因区域偏好性 |
| 4.2.3 非编码RNA偏好于发生远距离互作 |
| 4.2.4 RNA和 DNA对应的互作靶标数目大多低于10个 |
| 4.2.5 一些RNA在基因组上表现出广泛的结合信号 |
| 4.3 不同互作类型的RNA在染色质上的互作情况与实验验证 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 病原菌诱导后的RNA-染色质相互作用 |
| 5.1 DC3000 处理后系统性鉴定RNA-染色质相互作用 |
| 5.2 DC3000 处理后显着变化的RNA-染色质相互作用 |
| 5.3 NBS-LRR家族基因内存在RNA-染色质相互作用网络 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 热处理后的RNA-染色质相互作用 |
| 6.1 拟南芥的热处理条件 |
| 6.2 热处理后系统性鉴定RNA-染色质相互作用 |
| 6.3 热处理后显着变化的RNA-染色质相互作用 |
| 6.4 热响应基因间形成RNA-染色质相互作用网络 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 IAA诱导的RNA-染色质相互作用 |
| 7.1 IAA处理后系统性鉴定RNA-染色质相互作用 |
| 7.2 IAA处理后显着变化的RNA-染色质相互作用 |
| 7.3 IAA信号通路内的RNA-染色质相互作用情况 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 组蛋白甲基转移酶在植物di RNA生成及DNA双链断裂修复中的作用及其机制研究 |
| 8.1 利用DGU.US系统杂交筛选参与di RNA生成及DNA双链断裂修复的组蛋白甲基转移酶 |
| 8.1.1 突变体杂交筛选及GUS表型分析 |
| 8.1.2 各组蛋白甲基转移酶突变体中的DSB修复效率均有所降低 |
| 8.1.3 在多个组蛋白甲基转移酶突变体中,di RNA的积累量发生变化 |
| 8.2 小结 |
| 第9章 总结与展望 |
| 9.1 论文总结 |
| 9.2 论文展望 |
| 9.2.1 运用特定组织或特定类型的细胞构建GRID-seq文库 |
| 9.2.2 探究非编码RNA的生物学功能 |
| 9.2.3 探究蛋白编码RNA介导的远距离相互作用所具有的生物学意义 |
| 9.2.4 探究同一信号通路内部基因之间的RNA-染色质相互作用网络 |
| 9.2.5 探究拟南芥基因组中潜在的DNA顺式调控元件 |
| 9.2.6 探究拟南芥中RNA在染色质空间结构变化中的作用 |
| 9.2.7 探究拟南芥中组蛋白甲基转移酶ASHR3、ATXR7及SUVH2在di RNA介导的DSB修复通路中的作用机制 |
| 9.2.8 探究拟南芥中组蛋白甲基转移酶在DSB修复通路中的作用机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 附录 |
（4）转基因家蚕后部丝腺表达丝胶蛋白SER3对血淋巴黑化免疫的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 转基因家蚕的发展与应用 |
| 1.1.1 昆虫转座元件 |
| 1.1.2 家蚕转基因技术 |
| 1.1.3 家蚕丝腺生物反应器的发展与应用 |
| 1.1.4 转基因家蚕安全性 |
| 1.2 家蚕黑化免疫 |
| 1.2.1 黑化免疫在先天免疫的角色扮演 |
| 1.2.2 黑色素形成 |
| 1.2.3 酚氧化酶的分子调控 |
| 1.2.4 氧化应激与黑色素 |
| 1.3 论文研究思路 |
| 1.3.1 研究目的与意义 |
| 1.3.2 研究目标与内容 |
| 1.3.3 研究技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物及管理 |
| 2.2 实验主要仪器 |
| 2.3 实验主要试剂盒和试剂 |
| 2.4 主要溶液的配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 血淋巴黑化速度调查 |
| 2.5.2 血浆制备 |
| 2.5.3 组织蛋白质提取 |
| 2.5.4 BCA法测定组织蛋白浓度 |
| 2.5.5 游离代谢物含量测定 |
| 2.5.6 黑色素含量测定 |
| 2.5.7 酚氧化酶活性测定 |
| 2.5.8 总RNA提取 |
| 2.5.9 DNA消化 |
| 2.5.10 RNA反转录 |
| 2.5.11 半定量PCR |
| 2.5.12 定量PCR |
| 2.5.13 ELISA |
| 2.5.14 血淋巴蛋白酶抑制剂活性检测 |
| 2.5.15 血淋巴氧化还原系统相关酶活性和底物含量检测 |
| 2.5.16 免疫诱导 |
| 2.5.17 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 后部丝腺表达Ser3对血淋巴黑化能力的影响 |
| 3.2 后部丝腺表达Ser3对血淋巴黑色素形成的分子调控影响 |
| 3.2.1 血淋巴中黑色素合成底物芳香族氨基酸含量升高 |
| 3.2.2 血淋巴中黑色素合成生化通路受到影响 |
| 3.2.3 血淋巴和脂肪体中丝氨酸蛋白酶基因转录水平上调 |
| 3.2.4 血淋巴和脂肪体中丝氨酸蛋白酶抑制剂基因转录水平上调 |
| 3.2.5 血淋巴中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性提高 |
| 3.2.6 血淋巴中酚氧化酶(PO)转录因子的表达水平上调 |
| 3.3 后部丝腺表达Ser3改变血淋巴氧化还原代谢 |
| 3.4 后部丝腺表达Ser3对家蚕抗逆性及体液免疫的影响 |
| 3.4.1 增强了家蚕对细菌侵染的抵抗性 |
| 3.4.2 降低了血淋巴黑化免疫能力 |
| 3.4.3 上调了血淋巴体液免疫能力 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 综合讨论 |
| 4.1.1 后部丝腺表达Ser3影响血淋巴代谢 |
| 4.1.2 后部丝腺表达Ser3影响血淋巴黑色素合成 |
| 4.1.3 后部丝腺表达Ser3对家蚕的抗菌和抗高温性能具有不同影响 |
| 4.2 全文结论 |
| 4.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间参与项目与科研成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）Ttk维持肠祖细胞分化机制及Hbs1对精子发生影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 选题背景概述 |
| 1.2 背景知识与研究进展综述 |
| 1.2.1 成体果蝇肠道干细胞的分化与调控 |
| 1.2.2 Ttk的研究进展 |
| 1.2.3 果蝇的精子发生与调节 |
| 1.2.4 Hbs1/Pelo复合体的研究进展 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 1.4 论文结构 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 果蝇品系 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 其他实验试剂 |
| 2.2 果蝇遗传操作系统 |
| 2.2.1 Gal4/UAS/Gal80 过表达系统 |
| 2.2.2 FLP-out/Gal4 嵌合体分析系统 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 果蝇遗传筛选实验 |
| 2.4.2 果蝇肠道(精巢)免疫组化染色与观察 |
| 2.4.3 果蝇肠道冰冻切片 |
| 2.4.4 少量细胞表达谱分析 |
| 2.4.5 DamID用果蝇品系构建 |
| 2.4.6 DamID测序及分析 |
| 2.4.7 ATAC-seq建库及分析 |
| 2.4.8 P element介导Hbs1 基因突变及筛选 |
| 2.4.9 精巢m RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR检测 |
| 2.4.10 繁殖能力实验 |
| 2.4.11 精巢内容物分析 |
| 2.4.12 酵母双杂交实验 |
| 2.4.13 数据统计分析与图像处理 |
| 第3章 Ttk维持肠祖细胞正常分化机制的研究 |
| 3.1 敲低肠祖细胞中的ttk导致表达神经特异性基因肿瘤的产生 |
| 3.1.1 敲低肠道祖细胞中的ttk形成前体细胞的肿瘤 |
| 3.1.2 ttk敲低形成的肿瘤细胞中神经特异性基因异常表达 |
| 3.2 神经特异性基因dpn是敲低ttk后肿瘤产生的关键因子 |
| 3.2.1 敲低dpn抑制ttk敲低后肿瘤的形成 |
| 3.2.2 过表达dpn可以产生与敲低ttk表达谱类似的肿瘤细胞 |
| 3.2.3 讨论与小结 |
| 3.3 敲低ttk诱导dpn和其他神经系统相关基因异常表达机制研究 |
| 3.3.1 Ttk对 dpn的抑制作用可能是间接的 |
| 3.3.2 敲低ttk增加dpn和其他神经特异Notch靶基因处Su(H)的结合 |
| 3.3.3 Seq是敲低ttk后导致神经特异Notch靶基因上调的重要因子 |
| 3.3.4 Seq可以直接与神经特异Notch靶基因结合,促进Su(H)的结合 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 单一分化潜能的肠前体EB细胞仍需要ttk维持分化稳态 |
| 3.5 对Ttk抑制ee机制的探讨 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 Hbs1对精子发生影响的研究 |
| 4.1 Hbs1突变导致雄性果蝇不育 |
| 4.2 Hbs1突变在雄性果蝇精子发生中的作用研究 |
| 4.2.1 Hbs1突变不影响精巢生殖干细胞功能 |
| 4.2.2 Hbs1突变导致精子发生过程中减数分裂的异常 |
| 4.2.3 Hbs1突变影响精子个体化进程 |
| 4.3 Hbs1突变导致精子发生异常的机制研究 |
| 4.3.1 Hbs1与Pelo具有遗传学上的相互作用 |
| 4.3.2 Hbs1与Pelo存在体内的共定位和体外的相互作用 |
| 4.3.3 与Hbs1 的结合位点对于Pelo在精子发生中的作用至关重要 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 论文总结 |
| 5.1.1 Ttk在果蝇肠道中的作用和作用机制总结 |
| 5.1.2 Hbs1 可能通过与Pelo组成复合体参与精子发生的调控 |
| 5.2 论文展望 |
| 5.2.1 对Ttk控制细胞命运作用的思考 |
| 5.2.2 Notch信号通路靶点特异性调节的探讨 |
| 5.2.3 对于Hbs1/Pelo在精子发生中作用机制的探讨 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）家蚕BmPSI及其互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 性别决定 |
| 1.1.1 遗传性别决定机制 |
| 1.1.2 环境性别决定机制 |
| 1.2 果蝇的性别决定 |
| 1.2.1 果蝇性别决定通路 |
| 1.2.2 果蝇中PSI基因的研究 |
| 1.3 家蚕的性别决定 |
| 1.3.1 家蚕性别通路 |
| 1.3.2 家蚕BmPSI基因的研究 |
| 1.4 家蚕BmSPX的发现 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 目的与意义 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 技术路线 |
| 第3章 家蚕BmPSI的蛋白性质及表达谱分析 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂及仪器 |
| 3.1.3 实验主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 定量引物设计 |
| 3.2.2 蛋白性质在线分析 |
| 3.2.3 五龄第三天各组织RNA的提取 |
| 3.2.4 cDNA合成 |
| 3.2.5 Actin3 检测cDNA质量 |
| 3.2.6 荧光定量PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 BmPSI蛋白性质分析 |
| 3.3.2 BmPSI蛋白结构预测 |
| 3.3.3 BmPSI各组织表达定量分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 BmPSI蛋白表达及性质研究 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂和仪器 |
| 4.1.3 实验主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 BmPSI全长引物的设计 |
| 4.2.2 BmPSI的克隆 |
| 4.2.3 重组原核表达载体的构建 |
| 4.2.4 蛋白小量诱导表达检测 |
| 4.2.5 BmPSI蛋白原核诱导表达及纯化 |
| 4.2.6 抗体制备及抗体效果检测 |
| 4.2.7 BmPSI在家蚕组织表达检测 |
| 4.2.8 BmPSI时期表达情况检测 |
| 4.2.9 BmPSI蛋白亚细胞定位 |
| 4.2.10 BmPSI蛋白二级结构测定 |
| 4.2.11 不同BmPSI剪切形式的发现 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BmPSI的克隆和载体构建 |
| 4.3.2 BmPSI的小量诱导表达 |
| 4.3.3 MBP-BmPSI蛋白的纯化 |
| 4.3.4 纯化后的BmPSI蛋白送制抗体,并进行蛋白二级结构测定 |
| 4.3.5 BmPSI多克隆抗体效果检测 |
| 4.3.6 蛋白水平检测BmPSI在精、卵巢中的表达 |
| 4.3.7 蛋白水平检测BmPSI在家蚕五起之后的表达情况 |
| 4.3.8 BmPSI-L的发现 |
| 4.3.9 BmPSI的蛋白定位 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 对BmPSI结合CE1 的关键位点研究 |
| 5.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂和仪器 |
| 5.1.3 实验主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 KH_1 结构域截短蛋白的纯化 |
| 5.2.2 借助BCA试剂盒调平蛋白浓度 |
| 5.2.3 截短蛋白的凝胶阻滞（EMSA）实验 |
| 5.2.4 BmPSI中 KH_1 结构域多序列比对 |
| 5.2.5 KH_1-1 关键氨基酸位点的突变引物设计 |
| 5.2.6 突变蛋白原核表达菌株的构建 |
| 5.2.7 突变蛋白的诱导表达和纯化 |
| 5.2.8 突变蛋白浓度调平及凝胶阻滞（EMSA）实验 |
| 5.2.9 等温滴定量热法检测蛋白与RNA的结合能力 |
| 5.2.10 对I116G、L127G及 mutIGGI突变蛋白二级结构的检测 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 BmPSI的截短设计 |
| 5.3.2 BmPSI的截短片段PCR扩增 |
| 5.3.3 BmPSI截短蛋白原核表达重组载体的构建 |
| 5.3.4 BmPSI截短蛋白的表达及纯化 |
| 5.3.5 截短蛋白浓度调平后的 EMSA（凝胶阻滞）实验 |
| 5.3.6 KH_1 多序列比对寻找结合RNA的关键氨基酸位点 |
| 5.3.7 BmPSI潜在关键结合位点的克隆及突变蛋白的表达 |
| 5.3.8 突变蛋白浓度调平后的 EMSA（凝胶阻滞）实验 |
| 5.3.9 ITC检测BmPSI及3 种关键位点突变蛋白结合CE1 的能力 |
| 5.3.10 对I116G、L127G及 mut IGGI突变蛋白二级结构的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 对SlPSI结合CE1 区段的保守性研究 |
| 6.1 实验材料与试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验试剂和仪器 |
| 6.1.3 实验主要溶液配制 |
| 6.2 实验方法与步骤 |
| 6.2.1 PSI基因进化树分析 |
| 6.2.2 Sldsx基因序列分析 |
| 6.2.3 多物种PSI蛋白KH_1-1 氨基酸多序列比对 |
| 6.2.4 SlPSI基因的克隆及原核表达载体构建 |
| 6.2.5 SlPSI的原核诱导表达及蛋白纯化 |
| 6.2.6 SlPSI与CE1探针之间的 EMSA 实验 |
| 6.2.7 SlPSI突变蛋白的设计引物合成 |
| 6.2.8 SlPSI突变蛋白的纯化 |
| 6.2.9 SlPSI 突变蛋白的 EMSA 实验 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 PSI基因进化树分析 |
| 6.3.2 Sldsx基因序列分析 |
| 6.3.3 PSI基因物种间多序列比对 |
| 6.3.4 SlPSI基因的克隆及原核表达载体的构建 |
| 6.3.5 SlPSI蛋白的表达纯化 |
| 6.3.6 SlPSI蛋白与CE1 结合的验证 |
| 6.3.7 SlPSI结合CE1 潜在关键位点突变蛋白的克隆 |
| 6.3.8 SlPSI 突变蛋白的 EMSA 结合实验 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 BmPSI互作蛋白BmSPX的功能研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.1.3 实验试剂 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 增量表达BmSPX的转基因品系的获得 |
| 7.2.2 BmSPX的生物信息学分析 |
| 7.2.3 转基因过表达BmSPX家蚕的下游靶基因检测 |
| 7.2.4 BmSPX与 BmPSI的结合验证 |
| 7.2.5 BmSPX的亚细胞定位 |
| 7.2.6 BmSPX与 BmPSI的结合验证 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 BmSPX转基因增量表达品系的建立 |
| 7.3.2 Over-BmSPX品系的转基因情况检测 |
| 7.3.3 Over-BmSPX品系家蚕表型观察 |
| 7.3.4 BmSPX蛋白性质分析 |
| 7.3.5 BmSPX蛋白结构预测 |
| 7.3.6 Over-BmSPX品系中家蚕性别关键基因的表达检测 |
| 7.3.7 BmSPX 与 BmPSI 的结合验证实验 |
| 7.3.8 BmSPX蛋白定位 |
| 7.3.9 BmSPX与 BmMasc之间互作研究 |
| 7.4 讨论 |
| 第8章 综合与讨论 |
| 8.1 家蚕BmPSI的蛋白性质及表达谱分析 |
| 8.2 BmPSI蛋白表达及性质研究 |
| 8.3 BmPSI结合CE1 的关键位点研究 |
| 8.4 SlPSI结合CE1 区段的保守性研究 |
| 8.5 BmSPX的功能研究 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参研课题 |
| 发表文章 |
| 参研课题 |
| 致谢 |
（7）PFBC致病基因XPR1果蝇同源基因CG10483功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 果蝇模型在生物学中的应用 |
| 1.1.2 黑腹果蝇介绍 |
| 1.2 PFBC概述 |
| 1.2.1 PFBC的致病基因XPR1 |
| 1.2.2 人类XPR1基因在果蝇中对应的同源基因 |
| 1.3 UAS-Gal4 系统 |
| 1.4 位点专一性重组 |
| 1.5 P因子插入 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 系统 |
| 1.7 GCaMp检测 |
| 1.8 研究背景与实验目的 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 本实验所涉及的实验仪器如表2-1 |
| 2.1.2 实验常用果蝇品系如表2-2 |
| 2.1.3 实验中所用载体与试剂如表2-3 |
| 2.1.4 主要培养基配方 |
| 2.1.5 实验所用试剂配方 |
| 2.1.6 实验所用引物如表2-8 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GCaMP对钙离子的检测 |
| 2.2.2 dXPR1基因CDS序列的获得 |
| 2.2.3 构建dXPR1高表达点突变载体 |
| 2.2.4 构建sgRNA表达载体 |
| 2.2.5 显微注射 |
| 2.2.6 转基因果蝇品系的筛选与建立 |
| 2.2.6.1 dXPR1高表达点突变果蝇品系的筛选与建立 |
| 2.2.6.2 dXPR1基因大片段缺失无功能突变体果蝇品系的筛选与建立 |
| 2.2.7 免疫印迹 |
| 2.2.8 果蝇大脑的大小测量及统计 |
| 第3章 结果和分析 |
| 3.1 高表达dXPR1基因会导致果蝇大脑细胞中Ca~(2+)浓度升高,敲减(RNAi)后Ca~(2+)浓度降低 |
| 3.2 UAS-dXPR1~(S136N)、UAS-dXPR1~(L145P)、UAS-dXPR1~(Ile575Val)转基因果蝇品系的获得 |
| 3.2.1 构建将dXPR1 CDS序列连入T载的质粒 |
| 3.2.2 构建dXPR1基因点突变高表达载体 |
| 3.2.3 高表达点突变果蝇品系的筛选与建立 |
| 3.3 dXPR1基因无功能突变体果蝇品系获得 |
| 3.3.1 构建dXPR1基因无功能突变体的sgRNA表达载体 |
| 3.3.2 获得dXPR1无功能突变体果蝇品系dXPR1~- |
| 第4章 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）CRISPR/Cas9系统介导的小菜蛾（Plutella xylostella）基因编辑（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 昆虫的遗传转化与基因组编辑 |
| 1.1.1 转座子介导的遗传转化 |
| 1.1.2 位点特异性整合酶 |
| 1.1.3 归巢内切酶 |
| 1.1.4 人工核酸酶技术 |
| 1.1.5 RNA靶向的核酸酶技术 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统及应用 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入 |
| 1.2.3 基于CRISPR/Cas9系统的转录激活与抑制 |
| 1.2.4 基于CRISPR/Cas9系统的荧光原位杂交 |
| 1.3 害虫的遗传调控 |
| 1.3.1 基于辐射的昆虫不育技术 |
| 1.3.2 释放显性致死昆虫的遗传调控技术 |
| 1.3.3 Gene drive系统 |
| 1.4 立题意义与总体思路 |
| 1.4.1 立题意义 |
| 1.4.2 总体思路 |
| 第二章 CRISPR/Cas9系统介导Pxabd-A敲除 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试小菜蛾品系 |
| 2.1.2 小菜蛾Pxabd-A的克隆 |
| 2.1.3 Pxabd-A进化树的构建 |
| 2.1.4 Pxabd-A蛋白3D结构模型预测 |
| 2.1.5 Pxabd-A表达模式分析 |
| 2.1.6 体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA |
| 2.1.7 胚胎的显微注射 |
| 2.1.8 表型的鉴定与突变检测 |
| 2.1.9 G_1代个体的表型观察与基因型检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Pxabd-A的序列结构和特征 |
| 2.2.2 Pxabd-A的进化分析 |
| 2.2.3 Pxabd-A蛋白3D结构模型 |
| 2.2.4 Pxabd-A的表达模式分析 |
| 2.2.5 Pxabd-A破坏后的表型效应 |
| 2.2.6 CRISPR/Cas9系统介导Pxabd-A定点突变 |
| 2.2.7 CRISPR/Cas9系统介导的突变可稳定遗传 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 CRISPR/Cas9系统介导PxUbx与PxAntp敲除 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 基因特异性sgRNA的设计及体外转录 |
| 3.1.2 胚胎的显微注射 |
| 3.1.3 表型观察及突变检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PxAntp sgRNA靶点的选择 |
| 3.2.2 PxUbx sgRNA靶点的选择 |
| 3.2.3 CRISPR/Cas9系统介导的PxAntp缺失表型 |
| 3.2.4 CRISPR/Cas9系统介导的PxUbx缺失表型 |
| 3.2.5 CRISPR/Cas9系统介导PxUbx与PxAntp的定点突变 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 小菜蛾内源PolⅢ型U6启动子的鉴定与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 小菜蛾细胞系的培养 |
| 4.1.2 小菜蛾内源U6启动子的克隆 |
| 4.1.3 U6:shRNA表达质粒的构建及细胞内的RNAi分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 PxU6启动子的鉴定与分析 |
| 4.2.2 克隆的PxU6启动子的表达效率 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 U6:sgRNA表达载体介导小菜蛾细胞系与个体内基因敲除 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试昆虫与细胞系 |
| 5.1.2 U6:sgRNA-EGFP表达质粒的构建及细胞转染 |
| 5.1.3 PxU6:3:sgRNA-abd-A表达载体的构建及胚胎显微注射 |
| 5.1.4 表型观察及靶点突变分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 小菜蛾细胞中PxU6:3:sgRNA介导EGFP的敲除 |
| 5.2.2 U6:sgRNA表达质粒参与介导Pxabd-A定点靶向 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 tRNA-gRNA表达策略的应用与基于CRISRP的gene drive系统 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 小菜蛾品系及其饲养 |
| 6.1.2 质粒的构建 |
| 6.1.3 RNA的体外转录获得 |
| 6.1.4 小菜蛾的胚胎显微注射 |
| 6.1.5 观察与检测 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 tRNA-sgRNA表达质粒参与介导的Pxabd-A敲除 |
| 6.2.2 基于CRISPR的gene drive构建 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
（9）多梳蛋白抑制复合体1对内源性反转录病毒MLV的靶向机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 内源性反转录病毒的进化历程及发展 |
| 1.1.1 ERV的发现及序列组成 |
| 1.1.2 MLV |
| 1.1.3 ERV参与宿主发育及癌症的发生 |
| 1.2 ERV沉默的相关机制 |
| 1.2.1 DNA甲基化修饰 |
| 1.2.2 组蛋白甲基化修饰 |
| 1.2.3 组蛋白去乙酰化 |
| 1.2.4 DNA/组蛋白修饰调控网络枢纽因子KAP1 |
| 1.2.5 组蛋白变体修饰 |
| 1.2.6 其它抑制机制 |
| 1.3 多梳蛋白家族 |
| 1.3.1 多梳蛋白家族及其组成 |
| 1.3.2 PRC1 参与的相关调控 |
| 1.3.3 PRC1 核心蛋白-CBXs |
| 1.4 PRC1与ERV之间的关系 |
| 1.5 本课题的主要研究内容及研究意义 |
| 1.5.1 课题出发点及主要研究内容 |
| 1.5.2 研究意义及应用前景 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体及细胞株 |
| 2.1.2 试剂与抗体 |
| 2.1.3 仪器与耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 对不同遗传背景的小鼠胚胎干细胞系进行干细胞性状检测 |
| 2.2.2 可诱导表达外源CBX7的pTRIPZ-Cbx7-Venus-Flag的载体的构建 |
| 2.2.3 基于构建可诱导性过表达CBX7 荧光报告基因的稳转细胞系的构建 |
| 2.2.4 稳转细胞系相关表型及功能学鉴定: |
| 2.2.5 相关MLV的 Genotyping引物设计 |
| 2.2.6 Genotyping |
| 2.2.7 染色质免疫共沉淀 |
| 2.2.8 Real-time PCR |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 不同遗传背景下小鼠胚胎干细胞多能性的分析 |
| 3.1.1 形态学及检测 |
| 3.1.2 不同细胞系中多能性标志基因表达量的检测 |
| 3.2 Cbx7 融合荧光报告基因质粒的构建及验证 |
| 3.3 稳转细胞系pTRIPZ-Cbx7-Venus的验证 |
| 3.4 MLV在不同细胞背景下进行Genotyping检测 |
| 3.4.1 不同序列组成的MLV的分类 |
| 3.4.2 不同遗传背景下的小鼠基因组中MLV的存在形式各异 |
| 3.5 ChIP检测PRC1 在不同的MLV上的靶向情况 |
| 3.5.1 PcG在经典靶基因上表现为高程度富集 |
| 3.5.2 PRC1 不识别序列组成完整或近似完整型MLV |
| 3.5.3 PRC1 特异性识别序列组成缺失型MLV |
| 3.5.4 序列组成缺失型MLV自身可作为募集信号招募PRC1 |
| 第四章 结论 |
| 第五章 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）用于构建突变体库的piggyBac转座子和转座酶转基因鸡的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因鸡技术的研究进展 |
| 1.1.1 鸡胚的生殖发育模式 |
| 1.1.2 鸡胚体外培养的研究 |
| 1.1.3 利用DNA显微注射技术制备转基因鸡 |
| 1.1.4 利用病毒载体制备转基因鸡 |
| 1.1.5 利用鸡的胚胎干细胞制备转基因鸡 |
| 1.1.6 利用精原细胞制备转基因鸡 |
| 1.1.7 利用原始生殖细胞制备转基因鸡 |
| 1.2 转基因鸡的研究意义 |
| 1.2.1 利用转基因鸡生产药用蛋白 |
| 1.2.2 转基因鸡在遗传育种中发挥重要作用 |
| 1.2.3 转基因鸡在基因功能研究中的作用 |
| 1.3 转座子及其在转基因动物遗传分析中的应用 |
| 1.3.1 转座子概述 |
| 1.3.2 几种常用转座子的比较 |
| 1.4 piggyBac转座子在转基因研究中的应用 |
| 1.4.1 piggyBac转座子的发现 |
| 1.4.2 piggyBac转座子的转座机制 |
| 1.4.3 piggyBac转座子的应用 |
| 1.5 基因抓捕 |
| 1.5.1 几种常见的突变方法介绍 |
| 1.5.2 基因捕获特点及载体类型 |
| 1.5.3 基因捕获的应用 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 实验动物和实验鸡蛋 |
| 2.1.4 实验药品及试剂 |
| 2.1.5 实验试剂的配制 |
| 2.1.6 实验耗材和仪器 |
| 2.1.7 实验数据分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 感受态细胞的转化 |
| 2.2.3 菌落PCR |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 酶切反应 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 胶回收 |
| 2.2.8 质粒DNA制备 |
| 2.2.9 HotSHOT提取DNA法 |
| 2.2.10 DNA提取 |
| 2.2.11 DIG-Labeled Southern Blot |
| 2.2.12 反向PCR |
| 2.2.13 Genome walking |
| 2.2.14 组织总蛋白提取 |
| 2.2.15 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.2.16 Western Blot步骤 |
| 2.2.17 细胞培养 |
| 2.2.18 慢病毒包装 |
| 2.2.19 慢病毒滴度测定 |
| 2.2.20 转基因鸡制备流程 |
| 2.2.21 鸡的采精与输精 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 利用piggyBac转座子系统制备转基因鸡 |
| 3.1.1 载体验证 |
| 3.1.2 GO代piggyBac转座子转基因鸡的制备 |
| 3.1.3 GO代piggyBac转座子小鸡外源基因检测 |
| 3.1.4 筛选piggyBac转座子生殖腺嵌合体公鸡 |
| 3.1.5 G1代piggyBac转座子转基因鸡的鉴定 |
| 3.2 利用慢病毒系统制备转座酶PBase转基因鸡 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 包装慢病毒 |
| 3.2.3 鸡胚显微注射及培养 |
| 3.2.4 GO代转座酶转基因鸡外源基因检测 |
| 3.2.5 筛选转座酶生殖腺嵌合体公鸡 |
| 3.2.6 G1代转座酶转基因鸡的鉴定 |
| 3.3 讨论与展望 |
| 第四章 实验结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 1.1 前言 |
| 1.1.1 溶菌酶研究的重要性 |
| 1.1.2 溶菌酶的纯化方法研究 |
| 1.1.3 本研究的目的和意义 |
| 2.1 实验结果 |
| 2.1.1 筛选G3和G4代转基因鸡 |
| 2.1.2 G3和G4代转基因鸡重组人溶菌酶表达检测 |
| 2.1.3 重组人溶菌酶的分离纯化 |
| 2.1.4 重组人溶菌酶的性质分析 |
| 2.1.5 重组人溶菌酶的最适工作温度和pH值分析 |
| 2.1.6 重组人溶菌酶的热稳定性分析 |
| 2.1.7 重组人溶菌酶耐酸碱度的分析 |
| 3.1 讨论与展望 |
| 4.1 实验结论 |
| 5.1 参考文献 |
| 附录Ⅱ |
| 1 引物列表 |
| 2 转基因插入位点 |
| 3 pWPXL-4BP载体拼接序列 |
| 4 ZGs+4BP转染PGCs制备G1代piggyBac转基因鸡 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、环境对果蝇P转座因子的作用关系研究（论文参考文献）
- [1]地熊蜂基因组中活跃转座子的鉴定[D]. 王全贵. 中国农业科学院, 2021
- [2]转座子衍生基因的演变途径及对生物生长发育的影响[J]. 刘珂珂,汤定钦,周明兵. 中国细胞生物学学报, 2021(01)
- [3]全基因组水平研究拟南芥中RNA与染色质的相互作用[D]. 李兰霞. 清华大学, 2020
- [4]转基因家蚕后部丝腺表达丝胶蛋白SER3对血淋巴黑化免疫的影响[D]. 史美娟. 苏州大学, 2020(02)
- [5]Ttk维持肠祖细胞分化机制及Hbs1对精子发生影响的研究[D]. 李朝惠. 清华大学, 2019(07)
- [6]家蚕BmPSI及其互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx的调控研究[D]. 王瑶. 西南大学, 2019(01)
- [7]PFBC致病基因XPR1果蝇同源基因CG10483功能初探[D]. 王睿龙. 湖北大学, 2019
- [8]CRISPR/Cas9系统介导的小菜蛾（Plutella xylostella）基因编辑[D]. 黄宇萍. 福建农林大学, 2017(01)
- [9]多梳蛋白抑制复合体1对内源性反转录病毒MLV的靶向机制[D]. 张洋. 兰州大学, 2016(03)
- [10]用于构建突变体库的piggyBac转座子和转座酶转基因鸡的制备[D]. 吴寒宇. 中国农业大学, 2016(04)