一、丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定（论文文献综述）
李琼毅[1]（2015）在《细胞内表达抗独特型单链抗体抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的研究》文中认为猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）为单股正链RNA病毒,与鼠乳酸脱氢酶增高病毒、马动脉炎病毒和猴出血热病毒同属套氏病毒目动脉炎病毒科,是全球性猪传染病—猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的病原。该病以母猪发生繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高热和高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。由于PRRSV表现出较其他RNA病毒更高的突变率,同时具有破坏宿主固有免疫系统的潜能,且迄今为止尚无有效的弱毒苗或灭活疫苗控制该病的发生与传播,PRRS几乎在世界上所有的养猪国家均有流行,造成了巨大的经济损失。本实验室早期研究证明PRRSV感染可产生针对GP5蛋白的抗独特型抗体,该抗体在机体抗病毒免疫应答及疾病转归中发挥重要作用;并且通过顺序免疫法得到了在功能上模拟PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2,研究证实该抗体仍保留自身抗独特型抗体的特性并且可下调弱毒苗对猪只的免疫保护作用。前期研究结果提示抗独特型抗体的功能较为复杂,其调控机体免疫应答的机制尚需要深入研究。然而,通过猪血清获得抗独特型抗体的数量有限且动物试验花费较大耗力较多,因此,构建细胞内表达单链抗体的细胞模型用于抗独特型抗体功能和免疫机制的前期研究更为理想。本论文的主要研究目的是构建抗独特型单链抗体的真核表达载体,经慢病毒转导使其在MARC-145细胞中表达,通过研究胞内表达抗独特型抗体后PRRSV的复制和增殖情况,验证其对病毒感染的影响并初步探索其产生机制。本课题研究的内容和结果如下:1.通过RT-PCR方法从Mab2-5G2杂交瘤细胞中分别扩增出重链可变区和轻链可变区基因,测序正确后通过弹性连接子（GGGGS）3经Overlap PCR连接组成一个完整的单链可变区抗体（scFv）;再用GPGP连接子将5G2scFv和EGFP融合表达并连接至慢病毒表达载体;以抗禽戊型肝炎病毒E抗原单克隆抗体1B5为模板,构建1B5scFv作为对照,构建质粒分别命名为pTRIP-CMV-5G2scFv-GPGP-EGFP-IRES-Puro和pTRIP-CMV-1B5scFv-GPGP-EGFP-IRES-Puro。测序结果证实慢病毒载体构建成功。2.使用293T细胞包装重组慢病毒,收集细胞上清将表达5G2scFv和1B5scFv的重组慢病毒转导MARC-145细胞,经嘌呤霉素抗性筛选和增强绿色荧光蛋白（EGFP）筛选单克隆。间接免疫荧光试验和Western blot试验证实5G2scFv或1B5scFv在MARC-145细胞中稳定表达,细胞系构建成功,分别命名为MARC-5G2scFv和MARC-1B5scFv。细胞活力试验结果提示细胞内表达单链抗体不影响细胞活力。3.为了验证细胞内表达5G2scFv是否抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制增殖,本研究对MARC-5G2scFv细胞系进行了攻毒试验。SD16和VR-2332毒株感染48h后,通过Western blot和TCID50方法分别检测N蛋白和子代病毒的产生。试验结果显示N蛋白表达量在MARC-5G2scFv细胞中显着下降,而在MARC-1B5scFv细胞和MARC-145中不受影响;与上述发现一致,同一时间MARC-5G2scFv上清中的病毒滴度也显着降低（P<0.05）。而且,该抑制作用在0.01MOI、0.1MOI和1MOI的接毒剂量时均可出现。接毒后不同时间收集上清并测定各组样品毒价后提示MARC-5G2sc Fv细胞上清中病毒滴度显着低于MARC-1B5scFv细胞和MARC-145细胞（P<0.05）,且在接毒后12h最为明显（P<0.001）。4.通过病毒吸附试验和检测I型干扰素表达初步探讨胞内表达5G2scFv下调病毒复制增殖的机制。荧光定量PCR和病毒滴度检测结果显示病毒吸附并无明显改变（P>0.05）,提示胞内表达5G2scFv不影响病毒吸附MARC-145细胞。I型干扰素转录和表达检测结果显示,接毒48h后,MARC-5G2scFv细胞中IFN-α的转录和表达较未感染的MARC-5G2scFv细胞及感染后MARC-1B5scFv和MARC-145细胞明显升高（P<0.05）,而在MARC-1B5scFv和MARC-145细胞中无明显变化（P>0.05）;但是三组细胞中IFN-β的转录和表达在感染前后均无明显改变（P>0.05）。以上结果提示胞内表达5G2scFv抑制病毒感染可能与IFN-α表达上调有关。综上所述,本研究通过构建抗独特型单链抗体并使其在MARC-145细胞中稳定表达,对5G2scFv胞内表达会否影响的PRRSV感染及其机制进行了一系列的研究。本试验首次构建稳定表达抗独特型单链抗体的MARC-145细胞系;证明其胞内表达可抑制病毒复制增殖;该作用并非通过抑制病毒吸附实现而与IFN-α分泌增加相关。本研究拓展了抗独特型单链抗体的应用,为寻找新的治疗方法和疫苗提供了新思路。
杜晓明[2]（2012）在《人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定》文中指出背景和目的Graves病患者血清中的促甲状腺素受体抗体（TRAb）分为:（1）TSH受体刺激性抗体（TSAb）;（2）TSH受体刺激阻断性抗体（TSBAb）;（3）中性TSH受体抗体。随着基因工程技术的发展,运用噬菌体展示技术,通过对人源性促甲状腺素抗体Fab片段抗体库的构建筛选、鉴定,得到TRAb单克隆抗体,为进一步建立TRAb的定量分析方法及探索免疫干预治疗奠定基础。方法（1）从血清TRAb浓度大于40IU/L的自身免疫性甲状腺疾病患者外周血中,抽提总RNA,反转录获取cDNA。以获取的cDNA为模版,PCR法扩增免疫球蛋白分子轻链λ、λ基因及重链Fd基因。将轻链克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库。将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,构建完成组合文库。（2）将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue,用辅助噬菌体M13K07感染,随机的组合文库表达于丝状噬菌体表面,完成噬菌体表面展示。（3）应用固相化抗原（TSHR-N）吸附筛选法通过数轮"吸附—洗脱—扩增"富集噬菌体抗体,筛选阳性克隆。（4）取阳性克隆的噬菌体DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-B1ue,以IPTG诱导表达可溶性TRAb Fab片段,应用间接ELISA法对表达产物进行鉴定。（5）利用亲和层析柱纯化人源性TRAb Fab片段,Western blotting鉴定纯化产物。（6）对表达较好的阳性克隆进行测序分析,轻链和重链可变区的DNA序列采用双向测序。结果（1）从外周血单个核细胞中抽提得到总RNA,并成功反转录获得cDNA文库。（2）PCR法扩增了大小均为680bp左右的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为1.32 × 105基因抗体库（轻链库）和库容为2.28 × 1 05Fab抗体库（组合文库）。（3）通过噬菌体表面展示技术,在辅助噬菌体M13K07的帮助下,在组合文库的基础上获得了富含TRAb Fab片段的人源性噬菌体抗体库。（4）以TSHR-N为抗原,通过固相化抗原吸附筛选法对构建的Fab噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,初步成功筛选到特异性TRAb Fab噬菌体抗体,富集效应约77倍。（5）通过Phage-ELISA检测,结果鉴定出了具有抗原结合活性的单克隆。提取阳性克隆的噬菌体DNA,切除gⅢ基因片段,实现了可溶性人源性TRAb Fab片段的表达。（6）利用Ni2+金属敖合层析法获得纯化的人源性TRAb Fab片段。（7）间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性TRAb Fab片段具有特异性结合TSHR-N端的免疫学活性。（8）经GenBank检索DNA序列分析,证实该克隆的轻链可变区与人的免疫球蛋白λ链同源性达到94.4%,重链可变区与人的免疫球蛋白IgG重链VH4同源性为88.9%。结论本研究通过噬菌体展示技术成功构建了人源性TRAb Fab片段组合文库,并通过固相化抗原吸附筛选法筛选获得阳性克隆,实现了可溶性TRAb Fab片段的表达,基因测序证实其轻重链与人免疫球蛋白可变区具有同源性,ELISA结果显示其具有特异性结合TSHR-N端的免疫学活性。
郑振华[3]（2009）在《基于CDR移植的高致病性禽流感病毒治疗性抗体人源化的初步研究》文中指出鼠单抗13D4（13D4mAb）是本实验筛选获得的一株针对高致病性禽流感（H5N1）的广谱中和单抗,在前期研究工作中,我们已经成功地对其进行了嵌合抗体（13D4cAb）的改造。血凝抑制试验（HI）和细胞中和实验已证实13D4cAb保留了亲本鼠单抗的广谱HI活性和中和活性,动物治疗试验也表明了13D4cAb对H5N1禽流感病毒具有广谱治疗效果。但嵌合抗体可变区中的鼠源序列仍然可以诱导人体产生HAMA,因此需要对其进一步人源化改造。本研究在13D4cAb的基础上,利用噬菌体展示技术进一步对其进行CDR移植改造。首先,选择同源性最高的人胚系基因1-69-04和1-39-01作为人源化模板;然后综合各种方法对13D4mAb可变区序列进行分析并确定骨架区上对抗体—抗原结合有影响的关键氨基酸残基,其中重链有12个,轻链有8个;利用简并引物对这些关键点进行回复突变,将人、鼠源译本同时编入人源化单链抗体库序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化单链抗体基因片段库;利用噬菌体展示技术构建人源化单链抗体库,实际库容量达到3×107;通过血凝素蛋白（HA1）和YU22病毒板对抗体库进行筛选,利用ELISA方法检测获得37个阳性克隆;选取16个阳性序列克隆入双启动真核表达载体Plan3,利用293FT细胞进行瞬时转染,通过血凝抑制实验（HI）检测各人源化抗体的活性及广谱性,初步确定5个具有较好HI活性和广谱性的人源化抗体,编号分别为H1126-08,H1213-21,H1202-34,H1121-37,Y1121-29;利用FLP-in系统筛选这5个人源化抗体的稳定表达细胞株并进行人源化抗体的表达和纯化;通过定量ELISA实验初步比较了这5个人源化抗体与HA1抗原的结合活性,其中H1213-21及H1202-34的活性最好,其人源化程度分别为88.9%和89.4%。总之,通过噬菌体展示技术本研究成功地对13D4cAb进行了CDR移植,获得了多个人源化抗体,他们基本上保持了13D4cAb的广谱HI活性及与HA1抗原的结合活性。这些人源化抗体将大大降低13D4用于治疗人感染H5N1时的HAMA反应,为禽流感治疗性抗体的临床应用奠定基础。同时,本文也证明了利用噬菌体展示技术进行CDR移植是一个高效,简便的方法。
钟彦伟,吴顺华,成军,徐东平,戴久增,高学松,曲建慧,王巧侠,李晓东,郭风劲,郭江,纪冬[4]（2006）在《应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因》文中研究指明目的筛选干扰素β（IFN-β）启动子DNA结合蛋白的基因,探讨IFN-β基因调节的分子生物学机制。方法应用噬菌体展示技术,以IFN-β启动子DNA的聚合酶链反应（PCR）产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的生物筛选过程,噬斑PCR扩增后,对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果噬菌体经富集后,随机挑选52个克隆,序列测定后经过同源性搜索,确定与IFN-β启动子具有结合作用的肝细胞蛋白有6种,包括谷胱甘肽S-转移酶（GST）,淀粉酶突变体蛋白,锌指蛋白等与细胞发育和代谢有关的蛋白。结论IFN-β启动子DNA与肝细胞中多种蛋白类型结合,为研究IFN-β基因在肝细胞中的表达调控奠定了基础。
成军[5]（2004）在《功能基因组学与肝脏疾病研究》文中认为功能基因组学是指应用整体的研究技术阐明基因和蛋白的生物学功能.因此,需要发展一些强大的分析技术,对基因和蛋白质的功能进行研究.这必将为肝脏病学的研究提供了一个前所未有的发展机遇.本文主要论述功能基因组学的先进技术在肝病领域的应用.
钟彦伟,成军,张忠东,李强,李莉,陈菊梅[6]（2004）在《丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达》文中进行了进一步梳理目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 （HCV）核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 （抗 Id）scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 （IPTG）诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 （ELISA）证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论 HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。
成军[7]（2004）在《噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用》文中研究说明噬菌体展示技术是一种目的基因在噬菌体表面的表达产物与亲和选择相结合的技术。噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质。初期阶段 ,噬菌体展示技术主要是用于单链可变区抗体、随机多肽库等的筛选 ,但近年来随着噬菌体cDNA表达型文库的构建 ,噬菌体展示技术的用途逐渐扩大。目前噬菌体展示技术不仅可以用于研究蛋白结合蛋白 ,而且还可以用来研究DNA/RNA结合蛋白 ,以及非蛋白小分子物质的结合蛋白等。因为蛋白 蛋白之间的结合是许多生物学效应的基础 ,因而噬菌体展示技术的应用范围进一步得到拓展。噬菌体展示技术在研究自身抗体结合与识别的自身抗原、信号转导过程中蛋白之间的相互作用以及肝炎病毒基因表达调节方面都有十分重要的应用前景。
成军[8]（2003）在《病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略》文中指出乙型肝炎病毒 （HBV）和丙型肝炎病毒 （HCV）感染引起病毒性肝炎的发病机制目前还有许多方面没有研究清楚。以肝炎病毒相关的新基因克隆化为主要目的的研究是病毒性肝炎发病机制研究领域中创新知识的重要源泉。病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节 ,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合 ,这种相互作用对于肝细胞正常的信号转导过程产生显着影响 ,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响 ,也可能是病毒性肝炎、肝细胞癌 （HCC）发病机制中的主要机制。酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等 ,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用 ,是促进慢性病毒性肝炎发病机制研究、探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径和手段。
钟彦伟,成军,张忠东,孙敏,李强,李克,王琳,李莉,张玲霞,陈菊梅[9]（2003）在《噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体》文中研究表明目的:制备丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的肝细胞结合蛋白6（HCBP6）的特异性人源化单链可变区抗体（scFv）。方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6（HCBP6）16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析。结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍。用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性。其中有30株克隆ELISA的吸光度（A450 nm）值较高（P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等）。对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白（BSA）的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱（P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178）,结合2次ELISA重复实验的/4值及竞争抑制实验结果,最后确定1株（P24）阳性克隆。提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTABSE载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区（FR）及互补决定区（CDR）的序列结构。结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv。
牟劲松,刘妍,王刚,成军,段惠娟,李克,陆荫英,王琳,王惠芬[10]（2003）在《应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因》文中研究说明目的:应用抑制性消减杂交技术（SSH）构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1（-）-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1（-）为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。
二、丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定（论文提纲范文）
（1）细胞内表达抗独特型单链抗体抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 PRRSV的分类 |
| 1.1.3 PRRSV的基因组结构及其编码蛋白的功能 |
| 1.1.4 PRRSV的致病机制 |
| 1.1.5 PRRSV免疫学研究进展 |
| 1.1.5.1 固有免疫应答 |
| 1.1.5.2 体液免疫应答 |
| 1.1.5.3 细胞免疫应答 |
| 1.1.6 PRRSV的诊断 |
| 1.1.6.1 临床症状和病理变化 |
| 1.1.6.2 实验室诊断 |
| 1.1.7 PRRSV的防治与疫苗研究进展 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行及传播 |
| 1.3 免疫网络调节与抗独特型抗体 |
| 1.4 单链抗体 |
| 1.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展 |
| 1.5.1 硫酸乙酰肝素（HS） |
| 1.5.2 唾液酸粘附素 （Sn） |
| 1.5.3 CD163分子 |
| 1.5.4 CD151分子 |
| 1.5.5 波形蛋白 (Vimentin) |
| 第二章 本研究工作的目的和意义 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 第三章 单链可变区抗体的克隆及真核表达载体的构建 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞和菌株 |
| 3.1.2 主要试剂及载体 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 杂交瘤细胞的复苏、培养和冻存 |
| 3.2.2 Mab2‐5G2杂交瘤细胞总RNA的提取 |
| 3.2.3 VH和VL cDNA的扩增与序列分析 |
| 3.2.3.1 RT‐PCR |
| 3.2.3.2 VH和VL PCR产物回收及序列比对 |
| 3.2.4 5G2scFv的构建与序列分析 |
| 3.2.5 融合表达EGFP的 5G2scFv真核表达载体的设计 |
| 3.2.5.1 构建融合表达EGFP的 5G2scFv |
| 3.2.5.2 融合表达scFv和EGFP的真核表达载体的构建 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 VH和VL的PCR扩增结果与序列分析 |
| 3.3.2 全长 5G2scFv的PCR扩增结果与序列分析 |
| 3.3.3 pTRIP‐CMV‐5G2scFv‐EGFP/pTRIP‐CMV‐1B5scFv‐EGFP‐Puro载体的构建 |
| 3.3.3.15G2scFv‐EGFP扩增结果及鉴定 |
| 3.3.3.2 真核表达载体pTRIP‐CMV‐5G2scFv‐EGFP和pTRIP‐CMV‐1B5scFv‐ ‐EGFP‐Puro的构建及鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于scFv中VH和VL之间弹性连接子（Flexial Linker）的选择 |
| 3.4.2 关于在 5G2scFv和EGFP之间GPGP连接子的选择 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 稳定表达 5G2scFv-EGFP和 1B5scFv-EGFP的MARC-145细胞系的建立 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 细胞和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 嘌呤霉素对MARC‐145细胞最小致死浓度的测定 |
| 4.2.2 重组慢病毒的包装 |
| 4.2.3 表达 5G2scFv/1B5scFv慢病毒的转导和细胞系的筛选 |
| 4.2.3.1 表达 5G2scFv/1B5scFv慢病毒转导MARC‐145 |
| 4.2.3.2 转导细胞系的筛选 |
| 4.2.4 稳定表达 5G2scFv‐EGFP和 1B5scFv‐EGFP细胞系的鉴定 |
| 4.2.4.1 RT‐PCR检测 5G2scFv/1B5scFv基因的表达 |
| 4.2.4.2 间接免疫荧光试验鉴定 5G2scFv的表达 |
| 4.2.4.3 Western blot检测筛选细胞系中scFv的表达 |
| 4.2.5 5G2scFv表达对细胞生长的影响 |
| 4.2.5.1 标准曲线的制备 |
| 4.2.5.2 生长曲线的测定 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 嘌呤霉素对MARC‐145细胞最小致死浓度的确定 |
| 4.3.2 稳定表达 5G2scFv和 1B5scFv的细胞系的筛选 |
| 4.3.3 稳定表达 5G2scFv和 1B5scFv细胞系的建立及鉴定 |
| 4.3.3.1 RT‐PCR检测 5G2scFv基因的表达 |
| 4.3.3.2 间接免疫荧光试验鉴定 5G2scFv及 1B5scFv的表达 |
| 4.3.3.3 Western blot鉴定筛选细胞系中scFv的表达 |
| 4.3.45G2scFv胞内表达对细胞生长的影响 |
| 4.3.4.1 标准曲线构建 |
| 4.3.4.2 生长曲线构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 选择慢病毒载体系统的原因 |
| 4.4.2 表达scFv的细胞系筛选及其表达对细胞生长的影响 |
| 4.4.3 稳定表达 5G2scFv的细胞系的鉴定 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 MARC-145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV感染的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 细胞和病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 稳定表达 5G2scFv的MARC‐145细胞对不同PRRSV毒株感染的影响 |
| 5.2.1.1 不同毒株在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖情况 |
| 5.2.1.2 间接免疫荧光检测不同剂量SD16在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 |
| 5.2.25G2scFv胞内表达后对子代病毒产生的影响 |
| 5.2.3 MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV吸附的影响 |
| 5.2.3.1 荧光定量RT‐PCR检测MARC‐5G2scFv细胞系对PRRSV吸附的影响 |
| 5.2.3.2 TCID50检测MARC‐145细胞内表达 5G2scFv后对PRRSV吸附的影响 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV增殖的影响 |
| 5.3.1.1 不同毒株PRRSV在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 |
| 5.3.1.2 不同浓度SD16在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 |
| 5.3.2 MARC‐145细胞内表达 5G2scFv后病毒的生长动力学曲线检测 |
| 5.3.3 MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv细胞对PRRSV吸附的影响 |
| 5.3.3.1 荧光定量PCR检测胞内表达 5G2scFv对病毒吸附的影响 |
| 5.3.3.2 TCID50检测胞内表达 5G2scFv对PRRSV吸附的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.15G2scFv胞内表达抑制PRRSV在MARC‐145细胞中的增殖 |
| 5.4.2 胞内表达 5G2scFv不影响PRRSV吸附MARC‐145细胞 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 胞内表达 5G2scFv上调IFN-α 抑制PRRSV增殖 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞和病毒 |
| 6.1.2 试剂和仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 荧光定量RT‐PCR检测IFN‐α 和IFN‐β 转录水平变化 |
| 6.2.2 ELISA检测IFN‐α 和IFN‐β 蛋白水平变化 |
| 6.2.2.1 绘制标准曲线 |
| 6.2.2.2 ELISA法检测IFN‐α 和IFN‐β 浓度 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 荧光定量RT‐PCR检测IFN‐α 和IFN‐β 转录水平变化 |
| 6.3.2 ELISA检测IFN‐α 和IFN‐β 蛋白水平变化 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点和进一步研究课题 |
| 创新点 |
| 下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 技术流程图 |
| 第一部分 人源性促甲状腺素受体抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 PCR引物 |
| 1.1.3 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 外周血总RNA提取 |
| 1.2.2 轻、重链基因PCR扩增 |
| 1.2.3 噬粒pComb3Hss的扩增 |
| 1.2.4 轻链库的构建 |
| 1.2.5 噬菌体Fab抗体库的构建和鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 单克隆抗体的发展 |
| 1.3.2 噬菌体抗体库成功构建的必要条件 |
| 1.3.3 辅助噬菌体作用机理以及扩增 |
| 1.3.4 噬菌体抗体库的机遇和挑战 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 人源性TRAb Fab片段的筛选及初步鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TRAb Fab噬菌体抗体的筛选结果 |
| 2.2.2 Phage-ELISA检测噬菌体抗体 |
| 2.2.3 TRAb阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.4 TRAb Fab片段的获取 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 用于筛选的抗原 |
| 2.3.2 噬菌体抗体库的筛选技术的原理及影响因素 |
| 2.3.3 人源性TRAb Fab噬菌体抗体的筛选 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 人源性TRAb Fab片段的初步纯化及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 可溶性TRAb Fab ELISA鉴定 |
| 3.2.2 SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.2.3 免疫学活性鉴定:Western-Blotting |
| 3.2.4 采用CBG定量法对可溶性TRAbFab的表达蛋白定量 |
| 3.2.5 抗体重链和轻链可变区DNA序列的测序分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述 促甲状腺素受体及其抗体 |
| 综述 噬菌体抗体库 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）基于CDR移植的高致病性禽流感病毒治疗性抗体人源化的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(ABBREVIATION) |
| 第一章 前言 |
| 1 抗体药物的发展历史 |
| 2 抗体的结构和作用机理 |
| 2.1 抗体的结构 |
| 2.2 抗体的作用机理 |
| 3 抗体人源化 |
| 3.1 嵌合抗体 |
| 3.2 人源化抗体 |
| 4 人源抗体 |
| 4.1 抗体库展示技术 |
| 4.2 人B细胞永生化技术 |
| 4.3 转基因小鼠 |
| 5 抗体的表达系统 |
| 5.1 哺乳动物细胞表达系统 |
| 5.2 大肠杆菌表达系统 |
| 5.3 酵母表达体系 |
| 5.4 植物细胞表达系统 |
| 5.5 转基因动物表达系统 |
| 6 抗体药物的应用 |
| 6.1 在肿瘤治疗方面的应用 |
| 6.2 在器官移植中的应用 |
| 6.3 在自身免疫性疾病方面的应用 |
| 6.4 在心血管疾病方面的应用 |
| 6.5 在感染性疾病方面的应用 |
| 7 高致病性禽流感 |
| 7.1 高致病性禽流感简介 |
| 7.2 高致病性禽流感的对策 |
| 7.3 抗体药物用于治疗高致病性禽流感 |
| 8 本论文研究的思路、目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂与材料 |
| 1.3 常用溶液及培养基配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 分子克隆常规操作 |
| 2.2 细胞试验常规操作 |
| 2.3 13D4mAb的人源化设计 |
| 2.4 13D4人源化单链抗体库的构建 |
| 2.5 13D4人源化单链抗体库的筛选和检测 |
| 2.6 13D4人源化抗体序列分析 |
| 2.7 13D4人源化抗体的构建 |
| 2.8 人源化抗体的表达及纯化 |
| 2.9 人源化抗体的鉴定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 13D4mAb人源化设计 |
| 1.1 人源化模板的选择 |
| 1.2 13D4mAb可变区序列分析 |
| 1.3 人源化抗体回复突变点的确定 |
| 2 13D4人源化单链抗体库的构建 |
| 2.1 人源化单链抗体库片段的获得 |
| 2.2 13D4人源化单链抗体库的构建 |
| 2.3 13D4人源化单链抗体库的扩增 |
| 3 13D4人源化单链抗体库的筛选和检测 |
| 3.1 固相筛选用抗原板的优化 |
| 3.2 抗体库的筛选 |
| 3.3 抗体库检测 |
| 4 13D4人源化抗体序列分析 |
| 5 13D4人源化抗体表达载体的构建 |
| 6 人源化抗体的表达及鉴定 |
| 6.1 人源化抗体的瞬时表达和广谱HI活性测定 |
| 6.2 稳定细胞株的筛选和人源化抗体的表达 |
| 6.3 抗体的纯化 |
| 6.4 人源化抗体与抗原结合能力的检测 |
| 第四章 讨论 |
| 1 13D4cAb的人源化设计 |
| 2 人源化单链抗体库的构建和筛选 |
| 3 抗体的表达 |
| 4 人源化抗体的活性检测 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 IFN-β启动子DNA的扩增 |
| 1.3 T7噬菌体文库扩增 |
| 1.4 生物筛选 |
| 1.5 噬斑的PCR扩增 |
| 1.6 序列测定及同源性搜索 |
| 2 结果 |
| 2.1 IFN-β启动子DNA片段的PCR扩增 |
| 2.2 肝细胞cDNA文库的筛选 |
| 2.3 目的基因的PCR扩增 |
| 2.4 序列比对和同源性分析 |
| 3 讨论 |
（5）功能基因组学与肝脏疾病研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 功能基因组学的定义和内涵 |
| 2 启动子DNA结合蛋白的研究 |
| 3 蛋白与蛋白分子之间的结合 |
| 4 差异显示研究技术 |
| 5 功能缺失表型分析策略 |
| 6 生物信息学技术 |
（7）噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用（论文提纲范文）
| 1 噬菌体展示技术与基因工程抗体、抗独特型抗体研究 |
| 2 噬菌体展示技术与模拟表位、拮抗多肽研究 |
| 3 噬菌体展示技术与DNA、RNA结合蛋白研究 |
| 4 噬菌体展示技术与蛋白结合蛋白研究 |
| 5 非蛋白小分子结合蛋白筛选 |
（8）病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略（论文提纲范文）
| 1 肝炎病毒DNA/RNA结合蛋白基因的克隆化 |
| 2 肝炎病毒蛋白结合蛋白基因的克隆化 |
| 3 肝炎病毒蛋白反式激活基因的克隆化 |
四、丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定（论文参考文献）
- [1]细胞内表达抗独特型单链抗体抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的研究[D]. 李琼毅. 西北农林科技大学, 2015(06)
- [2]人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定[D]. 杜晓明. 天津医科大学, 2012(08)
- [3]基于CDR移植的高致病性禽流感病毒治疗性抗体人源化的初步研究[D]. 郑振华. 厦门大学, 2009(12)
- [4]应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因[J]. 钟彦伟,吴顺华,成军,徐东平,戴久增,高学松,曲建慧,王巧侠,李晓东,郭风劲,郭江,纪冬. 免疫学杂志, 2006(01)
- [5]功能基因组学与肝脏疾病研究[J]. 成军. 世界华人消化杂志, 2004(01)
- [6]丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达[J]. 钟彦伟,成军,张忠东,李强,李莉,陈菊梅. 解放军医学杂志, 2004(01)
- [7]噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用[J]. 成军. 解放军医学杂志, 2004(01)
- [8]病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略[J]. 成军. 解放军医学杂志, 2003(09)
- [9]噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体[J]. 钟彦伟,成军,张忠东,孙敏,李强,李克,王琳,李莉,张玲霞,陈菊梅. 世界华人消化杂志, 2003(04)
- [10]应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因[J]. 牟劲松,刘妍,王刚,成军,段惠娟,李克,陆荫英,王琳,王惠芬. 世界华人消化杂志, 2003(04)