一、乳鼠嗅球及皮层神经元的原代培养和Netrin-4受体在神经元定位的初步研究（论文文献综述）
莫荔[1]（2019）在《PPAR-γ途径在小胶质细胞表型改变中作用机制的研究》文中指出小胶质细胞的激活参与多种中枢神经系统疾病的发生与发展,包括抑郁症,阿尔兹海默症,孤独症谱系障碍等疾病。小胶质细胞具有M1型（经典型激活）和M2型（替代型激活）两种不同的激活表型,这两种不同激活表型的小胶质细胞在大脑中发挥着截然不同的生物学功效。M1型小胶质细胞主要表达促炎性细胞因子,扩大神经炎症响应,造成组织损伤,发挥神经毒害性作用;而M2型小胶质细胞则能够表达更多的抗炎性细胞因子以及神经营养因子,抑制神经炎症响应,促进组织修复,发挥神经保护性作用。因此,探究小胶质细胞激活表型的转换机制具有十分重要的意义。在本课题中,我们通过检测小胶质细胞在干扰素-γ（IFN-γ）处理后激活表型的变化,探究小胶质细胞在IFN-γ刺激下的自稳态调节过程,并进一步探索在此过程中的潜在分子机制。我们通过分析小胶质细胞形态学、细胞因子表达水平,以及对于神经干/祖细胞（NSPCs）增殖与分化的影响,以确定小胶质细胞处于何种激活表型。实验结果表明,IFN-γ处理一段时间后的小胶质细胞,并不是始终表现为具有神经毒性的M1激活表型,而是在IFN-γ处理48 h后,激活表型由M1型向M2型转换,表达的抗炎性细胞因子与神经营养因子逐渐增多。相应的,其发挥的生物学功能也由神经毒害性转变为神经保护性,表现为促进NSPCs的增殖与分化,以及新生神经元的成熟。进一步研究发现,过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ（PPAR-γ）参与上述小胶质细胞激活表型转换的过程。在IFN-γ处理48 h后,PPAR-γ蛋白表达水平呈现显着上升的趋势。此后,我们用PPAR-γ拮抗剂GW9662以及激动剂Pioglitazone,分别处理IFN-γ诱导激活的小胶质细胞,结果表明GW9662处理阻断了小胶质细胞向M2型转换的过程,Pioglitazone处理则会加速这一进程。接下来,我们在体内进一步验证激活PPAR-γ信号通路对IFN-γ诱导激活的M1型小胶质细胞向M2型转换的影响。小鼠被给予侧脑室注射IFN-γ,海马区以及皮层区表现出促炎性细胞因子表达增加,抗炎性细胞因子以及神经营养因子表达减少的现象,并且造成小鼠一系列的行为学损伤,包括社交能力减弱,悬尾实验中绝望不动时间增长等异常现象,而Pioglitazone预处理则能够有效的改善IFN-γ所诱导的炎症相关细胞因子表达水平失衡以及行为损伤。上述结果表明,IFN-γ诱导激活的小胶质细胞呈现出时序相关的表型转换,PPAR-γ信号通路在此转换过程中发挥关键作用。
孙婷婷[2]（2016）在《miR-30c/sema3A调控成年神经再生的机理及对嗅觉和记忆的影响》文中提出背景：成年啮齿类和灵长类动物脑内绝大部分神经元没有再生能力,成年神经元再生能力仅局限于位于海马齿状回和侧脑室周围室下区的一部分干性细胞,并且随着年龄的增加,成年神经干细胞的增殖能力不断地降低。然而,神经干细胞的增殖和分化机理不是很清楚。近来的研究发现神经性疾病,特别是神经退行性疾病的发生与成年神经元的再生能力紧密相关。神经干细胞再生机理的揭示对神经学基础理论的拓展和在神经性疾病的诊治上具有重要的价值。轴突导向分子是一类可以引导神经元轴突在正确位置上形成突触的分泌性蛋白或跨膜蛋白。近年来的研究显示,这类分子特异性地在成年干细胞微环境中的神经元前体或神经干细胞中表达,且这类分子的一些亚类的缺失会引起室下区细胞分裂周期的变化或神经元前体迁移的异常,这些结果直接造成成年干细胞微区干性细胞的增殖的紊乱。microRNAs是一类内源性非编码小RNA,其通过转录后抑制或降解靶基因的形式参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。成年脑内的microRNAs和胚胎期相比呈现组织特异性的表达。有研究显示,microRNAs在成年干细胞再生过程中发挥重要功能。为深入阐释microRNAs在成年干细胞再生过程中所发挥的作用及揭示相关靶基因在成年干细胞再生过程中的功能,我们基于不同发育时期ncRNAs高通量测序结果,筛选到74个差异表达的microRNAs,其中miR-16和miR-30c的差异表达最为显着,且随着发育年龄的增加,其表达量大幅度地降低。随后我们利用靶基因预测软件预测其潜在调控的靶基因。并结合生物信息学手段对其靶基因的功能和分布进行分析,发现差异表达microRNAs的靶基因主要存在于脑内,其功能主要参与了细胞分化通路和轴突导向通路,随后通过microRNA-mRNA网络关系的分析筛选到sema3A轴突导向因子很可能通过与miR-16和miR-30c的相互作用而参与细胞的分化途径。截至目前,尚未见microRNA/sema3 A参与成年干细胞增殖和分化的相关报道。那么,miR-16和miR-30c是否通过负向调控sema3A而参与了成年干细胞的增殖和分化过程?又是哪些分子使轴突导向分子分支走向细胞增殖和分化方向,其机制又是怎样的呢?本课题将对此进行探讨。目的1. 基于高通量测序数据库,筛选与细胞分化和轴突导向相关的microRNAs;2.基于生物信息学方法和实验手段,明确miR-16, miR-30c与sema3A的靶向关系；3. 探讨miR-30c/sema3A对体内成年室下区新生神经元的影响；4. 揭示miR-30c/sema3 A影响成年室下区新生神经元的机制；5. 检测miR-30c对嗅球新生神经元的影响；6. 探讨miR-30c/sema3A在调控成年神经再生信号通路上的下游介导分子和机制；7. 检测miR-30c/sema3A引起的成年神经再生能力的改变对嗅觉和记忆的影响。方法1. 利用基因表达文库（Gene Expression Omnibus, GEO）高通量测序结果和系统聚类分析（Hierarchical Clustering, HCL）及自组织映射（Self-organization Mapping, SOM）表达模式分析,筛选不同发育时期间的差异表达microRNAs;2. 构建microRNAs上调和下调载体及双荧光素酶报告系统检测载体,合成microRNAs mimics等,通过双荧光素酶报告系统及qRT-PCR检测microRNAs和sema3A的表达量,确定microRNAs与sema3A基因之间的靶向关系；3. 构建microRNA上调和下调慢病毒载体,进行慢病毒包装,通过脑立体注射技术分别将microRNA上调和下调慢病毒注射到室管下区以检测microRNA对成年室下区新生神经元数量的影响,并通过流式分选（FACS）和qRT-PCR定量技术,检测microRNA和sema3A在此过程中对应表达量的变化；4.对成体室下区脑片和microRNA上调及下调处理的室下区原代神经元的形态进行分析,并利用实时细胞检测系统（RTCA）和流式细胞仪分别对细胞增殖和细胞周期进行检测；5. 利用BrdU对新生神经元进行追踪；通过脑立体注射技术将miR-30c上调和下调慢病毒分别注射到室管下区,之后对脑片的干细胞及分化细胞进行特异性免疫荧光显色,以检测miR-30c对室下区微区和嗅球内不同种系神经元的影响；利用TUNEL试剂盒对室下区凋亡情况进行检测；6. 设计GSK3P和c-myc siRNA,利用上述siRNA分别对神经母瘤细胞Neuro2A进行处理,随后对细胞的形态和增殖（RTCA）隋况进行检测,并利用蛋白免疫印迹对上述处理后的蛋白水平进行检测,以确定分子之间的相互关系；7. 对miR-30c过表达和下调后所引起的嗅球整体结构的变化进行检测,利用食物掩埋方法,检测miR-30c表达水平变化后对嗅觉行为的影响；并利用脑立体注射技术、BrdU新生神经元追踪技术、条件恐惧记忆和水迷宫行为学实验检测齿状回内niR-30c表达水平变化对海马新生神经元的影响及对海马的条件记忆和空间记忆的影响。结果1、筛选出能同时参与细胞增殖和轴突导向microRNAs我们基于GEO数据库,对不同发育时期室下区高通量ncRNA测序数据进行提取,随后对其进行方差分析,发现差异表达microRNA占8%（74个）,对这些microRNAs进行聚类分析和SOM表达模式分析后,发现差异表达microRNAs的表达模式有两种（逐渐增加型：63个microRNAs;逐渐下降型：11个microRNAs）。其中miR-16和miR-30c是差异表达最为显着的2个microRNAs,均属于表达模式降低型microRNAs。随后的生物信息学分析显示,sema3A可以通过同时参与两信号通路的miR-16和miR-30c而与细胞分化途径相联系。2、miR-30c是sema3A特异的调控因子通过双荧光素酶报告系统,我们发现miR-30c能够显着抑制sema3A的表达（55±1.2%,p<0.05）,当sema3A与miR-30c结合位点突变后,发现niR-30c对sema3A的抑制性被解除（78±4%,p>0.05）。而无论在sema3A的野生型报告系统还是突变型报告系统,miR-16对sema3A的表达均无影响。不同浓度的microRNAs mimics的双荧光素酶报告系统检测结果验证了上述结果的正确性。用上述载体和mimics处理Neuro2A细胞后,qRT-PCR检测microRNAs和sema3A的表达,发现miR-30的表达与sema3A呈负相关,而miR-16的表达与sema3A之间则无相关性。并且,在Neuro2A细胞中, sema3 A的表达与miR-30c上调载体呈现负相关；而与miR-30c下调载体的表达趋势高度一致。上述结果证实,miR-30c是sema3A的调控因子。3, miR-30c通过负向调控sema3A的表达增加新生神经元的数量利用BrdU分别对脑立体注射有miR-30c上调和下调慢病毒的小鼠进行新生神经元追踪,结果发现miR-30c上调后可明显促进室下区及迁移流内新生神经元的数量（室下区：4.59±1.74倍,p<0.01；迁移流：8.69±1.32倍,p<0.001）,miR-30c下调后的结果与此相反。利用流式细胞仪对室下区表达miR-30c上调和下调载体的细胞进行分选,随后的qRT-PCR结果显示miR-30c上调细胞中,sema3A的表达明显降低（0.41±0.012倍,p<0.001）；miR-30c下调细胞中,sema3A的表达明显增加（2.48±0.023倍,p<0.001）。此结果提示,miR-30c通过负向调控sema3A来影响室下区新生神经元的数量。4, miR-30c/sema3A通过调控细胞增殖和分化途径来影响新生神经元数量为了进一步检测miR-30c/sema3A是通过什么途径来影响室下区新生神经元的数量,我们利用miR-30c上调和下调慢病毒处理体外培养的室下区原代神经元,对其细胞形态进行检测,发现miR-30c上调后,室下区神经元分化程度明显降低,miR-30c下调后,室下区神经元分化程度得到加强。体内miR-30c上调和下调慢病毒侵染室下区脑片的细胞形态也印证了以上结果。随后,利用实时细胞检测技术（RTCA）分别对miR-30c上调和下调载体处理的Neuro2A的增殖进行检测,发现miR-30c上调后细胞增殖明显增强,而miR-30c下调后细胞增殖明显降低。进一步的细胞周期检测结果显示,miR-30c上调后,可以明显加速细胞周期的进程。而miR-30c下调后,明显抑制细胞周期的进程。5、GSK3p/c-myc介导了miR-30c/sema3A的细胞增殖和分化信号通路通过对相关文献和信号通路的分析,我们锁定GSK3β/c-myc分子作为备选的miR-30c/sema3A的下游信号介导分子。通过siRNA分别干扰GSK3β和c-myc,对细胞增殖和形态进行分析,我们发现GSK3β具有促进细胞分化抑制细胞增殖的功能,而c-myc的功能与此相反；联合miR-30c上调和下调后细胞增殖和分化的结果,及对上述处理组相应蛋白表达情况的鉴定,我们得出niR-30c上调后负向调控sema3A的表达,sema3A表达降低后,抑制GSK3β的活性,从而使c-myc Thr58位点磷酸化水平降低,c-myc总量增加,从而促进细胞增殖；miR-30c下调后结果与此相反。6、miR-30c引起的细胞增殖分化通路对嗅球和海马结构和功能的影响miR-30c表达水平的变化可以改变细胞增殖和分化速度,引起新生神经元数量的变化。为了检测1miR-30c对新生神经元迁移靶区的影响,我们分别对室下区和海马齿状回进行脑立体定位显微注射miR-30c上调和下调慢病毒。BrdU新生神经元追踪,干细胞和分化细胞特异性免疫荧光显色结果显示,miR-30c上调后,各处理组较之对照组在迁移速度上无差异。室下区、嗅球及海马齿状回处的新生神经元均增加,其中室下区神经干细胞比例增加而分化后细胞比例降低；对嗅球和海马神经元的检测结果显示,嗅球和海马干细胞和分化细胞都有一定比例增加。miR-30c下调后结果与上述相反。进一步的行为学检测结果显示,室下区miR-30c下调后,其嗅觉灵敏度明显降低p<0.05)；海马齿状回处miR-30c下调后,其条件恐惧记忆及空间记忆能力也均明显下降p值范围分别为：p<0.05；p<0.01)。而上述对应的miR-30c上调组和对照组相比其行为学上无明显差异。以上结果表明,miR-30c水平的变化,可以影响成年新生神经元的再生,并且一定数量的成年新生神经元有利于增强嗅觉灵敏度和改善海马的条件和空间记忆能力。结论基于以上研究,我们的结果首次揭示：1) miR-30c可以通过负向调控sema3A的方式参与成年神经再生过程；2)miR-30c/sema3A是通过调控成年神经干细胞的增殖和分化的方式来调控成年新生神经元的数量；3)GSK3β和c-myc很可能作为下游分子介导了miR-30c/sema3A对成年再生的调控；4)miR-30c/sema3A引起的室下区和海马齿状回处神经再生能力的改变直接影响嗅觉和学习记忆能力。
张志成[3]（2012）在《光感基因活化嗅鞘细胞的体外研究》文中研究表明目的：目前细胞移植修复脊髓损伤研究中存在两大不足：一，对脊髓损伤再生微环境中抑制因素的拮抗不够；二，对移植入脊髓内细胞的调控不足。研究表明，即便将细胞移植入脊髓内，脊髓再生微环境中仍存在大量的轴突再生抑制因子。最近的研究发现轴突胞膜上的Nogo受体复合体（NgR/p75NTR/Lingo-1）是发挥抑制轴突再生和髓鞘形成的作用共同通道，亲水的Lingo-1片段（Lingo-1-Fc）可通过对NgR结合位点的竞争，阻碍Lingo-1和NgR的结合，抑制Lingo-1的作用，从而拮抗再生微环境中的抑制因子。另外，细胞移植入损伤脊髓后，尚缺乏对植入体内细胞功能状态的活化及调控。OEG细胞已被广泛的应用于脊髓损伤的基础研究，并显示出了神经保护、穿越疤痕、再髓鞘化，及促进轴突再生的作用。光感基因ChR2能够稳定的表达在神经元细胞内，其为膜阳离子通道蛋白，经波长470nm蓝光刺激后产生钠离子内流引发动作电位，使神经元兴奋。既往研究表明大脑星型细胞可被光感基因调控，能否使用光感基因技术活化OEG细胞，同时使其分泌Lingo-1-Fc片段拮抗再生抑制因子，增强其修复脊髓损伤的作用。本研究试图通过光感基因活化OEG的体外研究探讨此问题，为OEG细胞体内移植后的光基因调控活化，提供科学基础和理论依据，以达到脊髓损伤微环境中促进因素和抑制因素的协调，获得更佳的修复效果。方法：构建光感基因ChR2和大鼠Lingo-1-Fc基因的慢病毒载体，体外转染大鼠OEG细胞，使用RT-PCR、ELISA、细胞内蛋白定位技术验证转染成功，即光感基因ChR2及Lingo-1-Fc蛋白的表达。根据LED闪光电路，自行设计制备LED蓝光光照装置，使用蓝光体外照射刺激OEG细胞，观察光刺激后OEG细胞的生物学反应，重点观察体外OEG细胞经光感基因调控后的存活、增殖、迁徙、分泌等功能的变化情况。采用光刺激后OEG细胞培养的上清液培养人神经母细胞瘤细胞，观察其对神经细胞的营养保护作用。结果：构建的慢病毒载体能够有效、安全、高效的转染OEG细胞，其最佳的转染MOI为10。OEG细胞内能够检测到目的基因的表达和分泌；蓝光LED光源波长为470nm，辐射照度能够达到光感基因调控刺激细胞的条件。与单纯纯化的OEG相比，蓝光刺激后期OEG细胞可以明显的增强其增殖活性，增加了神经营养因子的分泌，增强了OEG细胞的体外迁徙能力，增强了其对神经细胞的营养保护作用。结论: OEG细胞可被光感基因技术调控和活化；体外光刺激增强了OEG细胞的生理功能；光活化的OEG细胞促进了OEG的神经营养因子分泌功能，增强了细胞迁徙和增殖的能力，增强了神经保护作用，为体内移植后OEG的光活化调控提供了科学基础和理论依据。
余科科,汪思应,周仁平,张成岗[4]（2010）在《利用原代培养神经元研究netrin-4的受体定位》文中研究指明目的利用体外原代培养神经元,研究神经突起诱向因子netrin-4的受体,分析netrin-1已知受体DCC和UNC5H1作为netrin-4受体的可能性。方法改良Koh法培养出生12 h内Wistar乳鼠神经元,免疫细胞化学鉴定纯度;以碱性磷酸酶（AP）标记的netrin-4为配体,以神经元及转染DCC和UNC5H1的COS7细胞为对象,亲和细胞化学法检测netrin-4的受体;RT-PCR法分析神经元中netrin-4、DCC和UNC5H1的表达。结果成熟神经元胞核大,突起长,交织成网;以抗神经丝蛋白（NF）抗体行免疫细胞化学鉴定,纯度较高;转染DCC和UNC5H1的COS7能与AP4-netrin-4结合,定位在细胞膜上。结论建立起稳定的原代神经元培养法,并研究神经突起诱向因子受体的定位。DCC和UNC5H1可能是netrin-1与netrin-4的共受体。
刘清君[5]（2006）在《神经芯片及其在生物嗅觉传感机理中的研究》文中提出神经电生理研究,历来是神经科学研究的主要内容。但是,目前神经元电信号的记录,仍主要依赖于以膜片钳为代表的细胞膜微电极穿刺或钳制技术。该类方法因其对细胞的穿刺损害作用,难以实现长时程测量,同时也难以实现对神经元网络的多位点同时测量。有鉴于此,研究者们陆续采用微机械加工技术开展了基于细胞传感器（cell-based biosensor）的微电极阵列（microelectrode array,MEA）和场效应管（field effect transistor,FET）阵列等神经芯片（neurochip）技术的研究,用以实现神经元胞外电位的记录。作为一种体外检测的新型细胞芯片技术,其实质就是在MEA或FET阵列传感器芯片表面培养神经元,使神经元通过一层薄的电解液同芯片的电极或栅极相耦合,构成可以实现控制电路和神经系统双向通讯的生物芯片,从而对细胞的电生理特性进行传感测量。该技术以其可对多个细胞同时进行长期、无损检测的特点,已在药物筛选、环境检测等生物医学领域得到了初步的应用。同时,该芯片技术同样适用于神经系统在体研究,从而在脑的高级功能、神经修复、以及人工器官等研究领域展示出了诱人的前景。 本论文首先从器件设计和细胞培养两个关键技术入手,建立了小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells）来源的基于光寻址电位传感器（light addressable potentiometric sensor,LAPS）的新型神经芯片技术,并在药物筛选等研究的基础上,从离体与在体两个方面,将该技术应用到了生物嗅觉的研究之中,为神经芯片技术拓展了新的应用领域。本论文的主要内容和贡献如下: 1.利用LAPS的光寻址特性,实现了神经芯片的细胞跟踪定位检测。MEA和FET阵列芯片都有一个共同的局限,即由于检测位点均为芯片表面固定的电极或栅极,被测细胞需要培养生长在这些特定位点,所以给细胞培养技术提出了很高的要求。LAPS芯片则是基于微机械加工技术的另一类新型细胞传感器,细胞电位的改变可通过检测LAPS的光生电流得以测量。利用其光源的可寻址特性,方便对芯片表面随机培养细胞的跟踪定位,从而克服了上述阵列传感器固定检测位点几何特性的限制。
余科科[6]（2006）在《神经突起诱向因子（Netrin-4）受体的初步研究》文中研究指明目的：神经突起生长诱向因子Netrin是一种分泌蛋白，在神经发育所需的轴突诱向及细胞迁移中发挥双重诱向功能——吸引或排斥，主要依赖于生长锥所表达的不同受体结直肠癌缺失蛋白（DCC）或UNC5同源物（UNC5H），从而传递不同信息。本课题组在从事4～6月孕龄人胎肝cDNA文库大规模测序中发现一种新基因，经生物信息学分析确认为Netrin家族成员，即Netrin-4，已有研究证明Netrin-4具有轴突诱向功能，但尚未明确其受体及信号转导通路。本研究探讨了神经突起生长诱向因子Netrin-4的受体以及Netrin-1已知受体DCC和UNC5H1作为Netrin-4受体的可能性，为从蛋白水平研究其信号转导机制及生物学功能提供依据。方法：构建真核表达载体AP4-Netrin-4、AP4-Netrin-1，转染COS7细胞以获得含有碱性磷酸酶（AP）的融合蛋白。改良Koh法分离、原代培养出生12h内清洁级Wistar乳鼠的嗅球及皮层神经元，采用免疫细胞化学方法鉴定其纯度。AP4-Netrin-4融合蛋白与原代培养第7d的神经元孵育，以亲和细胞化学法及碱性磷酸酶原位显色间接反映Netrin-4受体在神经元的定位（因为该融合蛋白能和Netrin-4受体在细胞表面发生亲和反应，从而可用碱性磷酸酶显色进行检测）。以AP4-Netrin-4为配体，以编码DCC和UNC5H1的真核表达载体转染COS7细胞为对象，采用亲和细胞化学技术检测DCC、UNC5H1作为Netrin-4受体的可能性。再以原代培养神经元为对象，检测受体结合动力学、受体竞争结合动力学。结果：原代培养第7d的嗅球及皮层神经元胞体饱满，突起长并交织成网状：免疫细胞化学染色见神经丝蛋白（neurofilament）在神
吴军[7]（2005）在《NT-3基因修饰嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤再生的研究》文中指出目的:脊髓损伤是常见疾患,造成许多病人肢体功能的障碍。嗅鞘细胞（OEG）兼有雪旺氏细胞与星形胶质细胞的双重功能特点,它能伴从PNS进入CNS而不同于雪旺氏细胞仅局限于PNS中,克服雪旺氏细胞与成纤维细胞在脊髓移植中功能的不足;嗅鞘细胞能在损伤段为再生神经纤维形成髓鞘,保护其不受局部抑制因子的影响;嗅鞘细胞尚可分泌多种神经生长因子。OEG移植治疗脊髓损伤的具有良好的前景。但由于OEG本身表达神经营养因子的水平较低,尚不能满足轴突再生的需要,实验中在损伤稍远处观察到再生轴突的数量仍较少。NT-3是NTs家族众多的成员中最有效的一种,其对轴突再生的促进效果优于NGF和BDNF。但由于外源性神经营养因子不能通过血脑屏障,半衰期短,临床应用上尚缺乏安全有效的给药途径。本研究的目的是将携带NT-3基因的真核表达载体,通过非病毒转染途径转入OEG中,再将转染后OEG移植到脊髓损伤大鼠体内,以期促进大鼠胸脊髓损伤的恢复。 方法:将我室自形构建的质粒pEGFP-NT3,应用脂质体介导的方法将其导入体外培养的嗅鞘细胞,将其移植入急性脊髓损伤大鼠体内,连续观察12周时间,与接受单纯OEG、空白质粒转染OEG移植的脊髓损伤大鼠进行比较。 结果:转染后OEG体外可检测到NT3mRNA的表达量的增加,细胞裂解液可检测到NT-3蛋白的表达,同时,此上清对脊神经节细胞的存活与突起生长具促进作用。移植转染后OEG能在体内长期存活,表达NT-3基因,并较对照组更能
汪思应[8]（2005）在《基于c-Met受体抗癌先导分子的筛选及其对HGF/c-Met信号途径的阻断效应》文中研究指明恶性肿瘤细胞的侵袭和转移是肿瘤发展到晚期的必然结果和导致患者死亡的主要原因,但迄今为止,对肿瘤转移机制的研究尚未获得突破性的进展。而目前对肿瘤转移的研究热点主要集中在寻找与肿瘤转移相关的关键分子,借以设计抗肿瘤转移的药靶和早期诊断的生物标志。 肿瘤转移是一个复杂的过程,有多个分子参与其中,如:1) 转移起始期,E-cadherin、Ig超家族、选择素、整合素等参与肿瘤细胞间粘附减弱、脱落、与基质的粘附增强等:2) HGF/c-Met、Ets-1等促进肿瘤细胞分泌的蛋白水解酶及其抑制剂,促进肿瘤细胞降解胞外基质并穿过基底膜;3) 肿瘤细胞在运动因子,生长因子,归巢因子等的作用下,迁移到转移靶器官。其中,HGF、EGF、AMF、TGF、IFN-γ、IL-1/3/6、CD44等在肿瘤细胞的迁移和运动中发挥了重要作用;4) 在血管增生因子HGF、VEGF、bFGF、IL-8、PDGF等作用下,促进新生血管形成;肿瘤细胞增生,形成新的转移灶。其中HGF/c-Met信号系统几乎参与了肿瘤转移的各环节。c-Met也被公认为抗肿瘤的靶点之一。 本研究将以c-Met为对象,首先首先建立了HGF刺激的MDCK细胞（高表达c-Met受体）离散模型,在该模型上筛选小分子化合物库,期望发现一些小分子化合物能阻断HGF/c-Met信号途径,有抗肿瘤侵袭转移潜能。再以c-Met为诱饵蛋白,筛选噬菌体展示肽库,旨在发现HGF模拟肽或天然肽段,特异性结合c-Met受体,阻断HGF/c-Met信号途径,将来还可以将这些肽段改构,携带抗癌药物,特异性结合与肿瘤细胞表面c-Met受体,发挥抗肿瘤靶标作用。 在细胞离散模型上筛选小分子化合物库时,偶然发现了一种名为SU5416的小分子化合物,能够抑制HGF介导的MDCK细胞离散,随后在HepG2细胞上也得到了同样的实验结果。HGF结合c-Met受体后,激活c-Met介导的细胞信号转导
余科科,张成岗,汪思应[9]（2004）在《乳鼠嗅球及皮层神经元的原代培养和Netrin-4受体在神经元定位的初步研究》文中研究说明目的 培养原代嗅球及皮层神经元细胞 ,研究神经轴突生长诱向因子 （Netrin 4 ）受体在神经元细胞中的定位。方法 改良Koh法分离、培养出生 12h内Wistar乳鼠的嗅球及皮层神经元 ,采用免疫细胞化学方法鉴定其纯度。碱性磷酸酶 （AP）标记的Netrin 4融合蛋白与原代培养第 7d的神经元孵育 ,以亲和细胞化学法检测Netrin 4受体在神经元的定位。结果 原代培养第 7d的嗅球及皮层神经元胞体饱满 ,突起长并交织成网状 ;免疫细胞化学染色见神经丝蛋白（neurofilament）在神经元胞体及突起中表达 ;嗅球及皮层神经元的细胞膜上均有Netrin 4受体表达。结论 建立起高效、稳定的原代神经元培养方法并应用于神经突起生长诱向因子受体的定位研究。
二、乳鼠嗅球及皮层神经元的原代培养和Netrin-4受体在神经元定位的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳鼠嗅球及皮层神经元的原代培养和Netrin-4受体在神经元定位的初步研究（论文提纲范文）
（1）PPAR-γ途径在小胶质细胞表型改变中作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 小胶质细胞在CNS疾病中的作用 |
| 1.2.2 不同激活表型小胶质细胞的特征 |
| 1.2.3 PPAR-γ调控小胶质细胞激活表型 |
| 1.3 本课题的研究目的及内容 |
| 第二章 IFN-γ激活的小胶质细胞呈现出时序相关的表型转换 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.2.3 实验试剂来源 |
| 2.2.4 原代小胶质细胞培养与刺激 |
| 2.2.5 免疫荧光染色 |
| 2.2.6 实时定量PCR |
| 2.2.7 酶联免疫吸附测试(ELISA) |
| 2.2.8 NSPCs培养 |
| 2.2.9 小胶质细胞与NSPCs共培养 |
| 2.2.10 条件培养基培养NSPCs |
| 2.2.11 数据处理与统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 IFN-γ处理小胶质细胞的形态学变化 |
| 2.3.2 IFN-γ处理小胶质细胞增殖能力的变化 |
| 2.3.3 IFN-γ处理的小胶质细胞表达细胞因子的m RNA水平变化 |
| 2.3.4 IFN-γ处理的小胶质细胞表达细胞因子的蛋白水平变化 |
| 2.3.5 IFN-γ处理12 h、48 h的小胶质细胞对NSPCs增殖与分化的影响 |
| 2.3.6 IFN-γ处理12 h、48 h的小胶质细胞对神经元成熟的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 PPAR-γ途径参与IFN-γ激活小胶质细胞的表型转换 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.2.3 实验试剂来源及配制 |
| 3.2.4 原代小胶质细胞给药刺激 |
| 3.2.5 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 3.2.6 酶联免疫吸附测试(ELISA) |
| 3.2.7 实时定量PCR |
| 3.2.8 腹腔注射 |
| 3.2.9 侧脑室注射 |
| 3.2.10 免疫荧光染色 |
| 3.2.11 行为学检测 |
| 3.2.12 数据处理与统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 IFN-γ处理小胶质细胞中PPAR-γ表达水平的变化 |
| 3.3.2 GW9662对IFN-γ处理的小胶质细胞表达细胞因子的影响 |
| 3.3.3 IFN-γ与 GW9662 共处理的小胶质细胞对NSPCs增殖与分化的影响 |
| 3.3.4 Pioglitazone对 IFN-γ处理的小胶质细胞表达细胞因子的影响 |
| 3.3.5 IFN-γ与 Pioglitazone共处理的小胶质细胞对NSPCs增殖与分化的影响 |
| 3.3.6 Pioglitazone调节IFN-γ诱导的神经炎症 |
| 3.3.7 Pioglitazone改善IFN-γ诱导的小鼠异常行为 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 后续展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（2）miR-30c/sema3A调控成年神经再生的机理及对嗅觉和记忆的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写一览表 |
| 引言 |
| 第一章 基于数据库和生物信息学对细胞增殖相关MICRORNAS的筛选 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 MIR-30C是SEMA3A的负向调控因子 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 MIR-30C/SEMA3A对成年室下区神经元再生功能研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 MIR-30C调控成年室下区神经元增殖和分化功能研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 MIR-30C/SEMA3A对嗅球新生神经元的调控研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第六章 MIR-30C/SEMA3A下游介导分子的鉴定 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第七章 MIR-30C/SEMA3A对嗅球和海马结构及功能的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（3）光感基因活化嗅鞘细胞的体外研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ChR2 光感基因及 Lingo-1-Fc 基因慢病毒载体的构建 |
| 实验目的 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 光照装置试制及嗅鞘细胞体外转染研究 |
| 实验目的 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光刺激后嗅鞘细胞的生物学反应 |
| 实验目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 图片 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（4）利用原代培养神经元研究netrin-4的受体定位（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物: |
| 1.1.2 主要试剂: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 AP4-netrin-4重组质粒的构建: |
| 1.2.2 重组蛋白表达: |
| 1.2.3 神经元原代培养: |
| 1.2.4 免疫细胞化学鉴定神经元: |
| 1.2.5 亲和细胞化学: |
| 1.2.6 RT-PCR: |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒AP4-netrin-4的构建及蛋白表达 |
| 2.2 原代神经元的培养及鉴定 |
| 2.3 亲和细胞化学检测netrin-4的受体 |
| 2.4 RT-PCR |
| 3 讨论 |
（5）神经芯片及其在生物嗅觉传感机理中的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstraot |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 神经芯片的研究目的 |
| 1.2 神经芯片的研究现状 |
| 1.2.1 离体检测微电极阵列(MEA)神经芯片 |
| 1.2.2 在体检测微电极阵列(MEA)探针芯片 |
| 1.2.3 场效应晶体管(FET)阵列神经芯片 |
| 1.2.4 光寻址电位传感器(LAPS)神经芯片 |
| 1.3 神经芯片的应用研究 |
| 1.3.1 用于神经元网络研究 |
| 1.3.2 用于神经药理学研究 |
| 1.3.3 用于脑的高级功能研究 |
| 1.3.4 用于神经修复研究 |
| 1.4 本论文主要研究内容 |
| 1.5 本章参考文献 |
| 第二章 嗅觉神经芯片研究的生物学基础 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 细胞的生物电现象 |
| 2.2.1 神经细胞的静息电位和动作电位 |
| 2.2.2 心肌细胞的静息电位和动作电位 |
| 2.3 神经信息的传递过程 |
| 2.3.1 受体和跨膜信号转导 |
| 2.3.2 神经递质与突触传递 |
| 2.4 嗅觉感受的膜电位与信号转导机制 |
| 2.4.1 嗅觉感受细胞和气味受体 |
| 2.4.2 嗅觉信号转导的分子机制 |
| 2.5 嗅觉信息的编码 |
| 2.5.1 嗅觉感受细胞的嗅觉编码 |
| 2.5.2 嗅球细胞的嗅觉编码 |
| 2.5.3 嗅觉中枢的嗅觉编码 |
| 2.6 小结 |
| 2.7 本章参考文献 |
| 第三章 神经芯片的细胞与培养 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 神经芯片研究中的细胞来源 |
| 3.2.1 原代分离培养 |
| 3.2.2 转化细胞系传代培养 |
| 3.2.3 干细胞体外诱导分化培养 |
| 3.3 神经芯片的细胞培养环境条件 |
| 3.3.1 细胞的培养环境条件 |
| 3.3.2 神经芯片的培养条件 |
| 3.4 细胞的分离与原代培养 |
| 3.4.1 神经细胞的培养方法 |
| 3.4.2 心肌细胞的培养方法 |
| 3.4.3 嗅上皮细胞的培养方法 |
| 3.4.4 嗅球细胞的培养方法 |
| 3.5 小鼠胚胎干细胞体外诱导分化培养 |
| 3.5.1 神经干细胞体外诱导分化 |
| 3.5.2 神经细胞的免疫组化染色 |
| 3.5.3 心肌干细胞体外诱导分化 |
| 3.5.4 心肌细胞的免疫组化染色 |
| 3.6 小结 |
| 3.7 本章参考文献 |
| 第四章 LAPS神经芯片及其测试系统 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 LAPS的测量原理 |
| 4.2.1 LAPS的光生电流 |
| 4.2.2 LAPS细胞传感器 |
| 4.3 LAPS神经芯片的设计与测试原理 |
| 4.3.1 LAPS芯片的生物相容性 |
| 4.3.2 细胞与LAPS器件界面模型 |
| 4.3.3 LAPS神经芯片的测量原理 |
| 4.3.4 LAPS神经芯片的结构优化 |
| 4.4 LAPS神经芯片的制备 |
| 4.4.1 LAPS芯片的加工 |
| 4.4.2 LAPS器件的封装 |
| 4.5 LAPS神经芯片的测试系统 |
| 4.5.1 LAPS的细胞胞外电位测量系统 |
| 4.5.2 LAPS测试系统的细胞培养环境 |
| 4.5.3 LAPS芯片测试系统的性能评价 |
| 4.6 小结 |
| 4.7 本章参考文献 |
| 第五章 干细胞LAPS芯片及其在药物筛选中的应用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 细胞培养结果 |
| 5.2.1 海马神经元原代培养结果 |
| 5.2.2 心肌细胞的原代培养结果 |
| 5.2.3 神经干细胞的体外分化与培养结果 |
| 5.2.4 心肌干细胞的体外分化与培养结果 |
| 5.3 干细胞芯片的细胞电生理检测 |
| 5.3.1 神经细胞的电生理检测 |
| 5.3.2 心肌细胞的电生理检测 |
| 5.3.3 电生理信号的参数分析 |
| 5.4 干细胞芯片的药物筛选分析结果 |
| 5.5 干细胞芯片分析与讨论 |
| 5.6 小结 |
| 5.7 本章参考文献 |
| 第六章 嗅觉神经芯片用于气味检测机理的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 嗅觉神经芯片的仿生设计 |
| 6.3 嗅觉细胞在LAPS表面的培养 |
| 6.3.1 嗅觉感受细胞的培养结果 |
| 6.3.2 嗅球细胞的培养结果 |
| 6.4 嗅觉神经芯片的体外测试结果 |
| 6.4.1 嗅球僧帽细胞对谷氨酸刺激的响应 |
| 6.4.2 嗅粘膜感受细胞对气味分子的响应 |
| 6.5 嗅觉神经芯片分析与讨论 |
| 6.6 小结 |
| 6.7 本章参考文献 |
| 第七章 微探针芯片及其对嗅觉传感机理的在体研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 微探针及其测量系统 |
| 7.2.1 微探针的制备 |
| 7.2.2 循环伏安法电化学测量系统 |
| 7.3 微探针的多巴胺测量 |
| 7.3.1 微探针的Nafion处理 |
| 7.3.2 多巴胺的溶液测量 |
| 7.4 大鼠嗅粘膜单胺类神经递质的在体测量 |
| 7.4.1 基础水平测量 |
| 7.4.2 三叉神经刺激后测量 |
| 7.5 微探针芯片结果讨论 |
| 7.6 小结 |
| 7.7 本章参考文献 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 展望 |
| 8.2.1 嗅觉干细胞芯片研究展望 |
| 8.2.2 LAPS嗅觉芯片研究展望 |
| 8.2.3 嗅觉人工突触平台研究展望 |
| 8.3 本章参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 作者在攻读博士期间发表的文章 |
| 附录2 本文彩图 |
（6）神经突起诱向因子（Netrin-4）受体的初步研究（论文提纲范文）
| 英文略缩表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历及研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 神经突起生长诱向因子(Netrin)受体家族研究进展 |
（7）NT-3基因修饰嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤再生的研究（论文提纲范文）
| 1.缩写词 |
| 2.中文摘要 |
| 3.英文摘要 |
| 4.前言 |
| 5.实验部分 |
| 5.1 NT-3基因转染嗅鞘细胞的体外试验 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 5.2 NT-3基因修饰嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤修复的实验观察 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 6.结论 |
| 7.照片 |
| 8.综述 |
| 9.攻读学位期间发表文章情况 |
| 10.致谢 |
（8）基于c-Met受体抗癌先导分子的筛选及其对HGF/c-Met信号途径的阻断效应（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分：基于HGF／c-Met信号途径的小分子抗癌先导化合物的筛选及其抗肿瘤效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分：基于c-Met胞外区蛋白的小分子抗癌先导肽的筛选及其意义 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 工作业绩 |
| 综述：HGF-Met信号转导途径在肿瘤侵袭和转移中的作用的研究进展 |
（9）乳鼠嗅球及皮层神经元的原代培养和Netrin-4受体在神经元定位的初步研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 质粒及试剂 |
| 1.3 AP4-Netrin-4重组质粒的构建及蛋白表达 |
| 1.4 原代嗅球、皮层神经元培养 |
| 1.5 神经元免疫细胞化学染色 |
| 1.6 亲和细胞化学 |
| 2 结果 |
| 2.1 AP4-Netrin 4重组质粒的构建及蛋白表达 |
| 2.2 原代神经元的培养及鉴定 |
| 2.4 Netrin-4受体在神经元的定位 |
| 3 讨论 |
四、乳鼠嗅球及皮层神经元的原代培养和Netrin-4受体在神经元定位的初步研究（论文参考文献）
- [1]PPAR-γ途径在小胶质细胞表型改变中作用机制的研究[D]. 莫荔. 电子科技大学, 2019(01)
- [2]miR-30c/sema3A调控成年神经再生的机理及对嗅觉和记忆的影响[D]. 孙婷婷. 浙江大学, 2016(02)
- [3]光感基因活化嗅鞘细胞的体外研究[D]. 张志成. 中国人民解放军军医进修学院, 2012(11)
- [4]利用原代培养神经元研究netrin-4的受体定位[J]. 余科科,汪思应,周仁平,张成岗. 基础医学与临床, 2010(07)
- [5]神经芯片及其在生物嗅觉传感机理中的研究[D]. 刘清君. 浙江大学, 2006(09)
- [6]神经突起诱向因子（Netrin-4）受体的初步研究[D]. 余科科. 安徽医科大学, 2006(12)
- [7]NT-3基因修饰嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤再生的研究[D]. 吴军. 中国人民解放军军医进修学院, 2005(06)
- [8]基于c-Met受体抗癌先导分子的筛选及其对HGF/c-Met信号途径的阻断效应[D]. 汪思应. 安徽医科大学, 2005(07)
- [9]乳鼠嗅球及皮层神经元的原代培养和Netrin-4受体在神经元定位的初步研究[J]. 余科科,张成岗,汪思应. 安徽医科大学学报, 2004(06)