一、丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2～3部分基因cDNA克隆序列分析及表达（论文文献综述）
郑峰伟[1]（2017）在《猪瘟病毒非结构蛋白3的结构解析与功能研究》文中认为猪瘟（classical swine fever,CSF）是猪的一种高度致死性传染病,其病原体猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）为黄病毒科瘟病毒属成员。CSFV的基因组为正义的单股线状RNA,大小约12.3 kb,由两端的非翻译区（nontranslated region,NTR）和中间一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）构成。其ORF编码一条大的多聚蛋白（polyprotein）,Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B,经细胞和/或病毒编码的蛋白酶加工产生12种成熟的蛋白。其中非结构蛋白3（nonstructural protein 3,NS3）为一种多功能的蛋白,在病毒基因组复制和感染性病毒的产生中具有重要作用。本论文研究了 CSFV NS3的结构与功能,主要获得了以下成果:采用原核表达系统表达纯化了全长的NS3,在其N端融合了 NS3蛋白酶辅因子 NS4A 的多肽片段（NS4A protease cofactor segment,NS4APCS）,以下称为NS4APCS-3。将NS3丝氨酸蛋白酶活性位点突变（S163A）,构建了 NS3蛋白酶自切割活性丧失的突变体NS4APCS-3S163A。通过大肠杆菌大量表达,亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析进行分离纯化,制备了高纯度的NS4APCS-3S163A蛋白,经结晶初筛和条件优化,得到了高质量的八面体状晶体。经过X-ray衍射数据收集、分子置换和模型优化,解析出了 2.35 A的NS4APCS-3S163A晶体结构。发现了一个新的闭合式构象（closed conformation）,其C末端的5个氨基酸插入蛋白酶的活性口袋,类似于一种NS3-NS4A顺式切割（cis-cleavage）后的状态,且蛋白酶结构域位于解旋酶结构域的背面,主要与解旋酶结构域3相互作用,形成了一个大小约2200 A2的分子内相互作用界面;在NS3表面发现了一个连续的碱性区,推测可能参与解旋酶对底物的结合,尤其是蛋白酶表面的碱性区,暗示NS3蛋白酶对解旋酶刺激作用的分子机制。基于全长NS3的结构分析,将NS3分子内主要的界面相互作用分成3簇,第一簇包含了蛋白酶活性位点P侧（P-side）与解旋酶结构域3 C末端（残基679-683）的相互作用;第二簇包含了三个离子键和边缘的一个疏水性帽子;第三簇由蛋白酶N端桶状结构（N-barrel）的β7b-β8发卡结构,解旋酶结构域3的loop（残基559-563）和解旋酶结构域D2-D3 linker形成。针NS3界面的三簇相互作用,设计了 3组突变,分别引入NS3表达质粒和CSFV全长感染性克隆,研究了界面氨基酸突变对NS3 ATPase和helicase活性的影响,及对CSFV复制和蚀斑形成能力的影响。结果表明,界面突变导致NS3解旋酶活性出现不同程度的下降,但其ATPase活性却不受影响;病毒学试验表明,界面突变会显着降低感染性病毒的产生,病毒的蚀斑形成能力也显着下降。进一步对蛋白酶结构域表面参与形成连续碱性区的4个氨基酸进行突变研究。分别将H24（位于NS4APCS）,R50,K74,K94（位于NS3蛋白酶）突变为非极性的丙氨酸和酸性的天冬氨酸后,突变体NS3的ATPase活性不受影响,而helicase活性普遍下降;基于CSFV感染性克隆的突变分析表明,NS3蛋白酶结构域表面碱性氨基酸突变显着降低了 CSFV基因组的复制和感染性病毒的产生。以上结果暗示CSFV NS3蛋白酶结构域表面碱性区通过与RNA的结合在基因组复制的调节中发挥作用。我们的研究结果有助于加深对CSFV NS3结构与功能的关系以及NS3在病毒基因组复制和感染性病毒产生中作用机制的理解,为阐明CSFV的致病机制和发展疾病防治新技术提供了新的理论依据。
赵程[2]（2017）在《猪瘟病毒非结构蛋白p7及其对感染性病毒产生的调节》文中研究表明猪瘟（Classical swine fever,CSF）是猪的一种高度接触性、致死性传染病,由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）感染引起。猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）的广泛应用,有效地控制了猪瘟的爆发和大流行。但猪瘟在我国仍持续存在,呈现诸如非典型猪瘟、慢性猪瘟和持续感染等特点,给养猪业造成巨大危害。深入研究CSFV基因组编码蛋白的结构与功能,进而阐明病毒致病机制,是猪瘟病毒研究的重要方向之一。在CSFV基因组上,p7位于E2与NS2之间,是一种多功能离子通道蛋白,也是CSFV的毒力因子之一。在黄病毒科成员中,只有丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）和瘟病毒编码p7蛋白。目前已知HCV p7蛋白具有离子通道活性,通过介导病毒蛋白之间相互作用参与病毒粒子组装。但对瘟病毒p7的结构与功能及其在感染性病毒产生中作用的认识明显不足。为了揭示瘟病毒p7的结构与功能及其在感染性病毒产生中的作用,首先构建了 CSFVp7、E2和NS2真核表达质粒,研究了 p7与E2和NS2之间的相互作用。免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation assays,Co-IP）和荧光共聚焦（Confocal）实验结果证实,p7与NS2、E2与NS2、p7与p7之间存在蛋白-蛋白相互作用;而p7和E2的相互作用相对较弱。E2、p7和NS2蛋白在细胞中能够形成蛋白质复合物。通过分别构建p7和NS2的截短突变体,进行Co-IP和Confocal实验,研究发现p7第一个跨膜结构域（TM1）和NS2的TM1是二者相互作用的关键区域。另外,我们还构建了 E2p7前体蛋白和p7NS2联体蛋白的真核表达质粒,通过Co-IP和Confocal实验研究发现,与E2蛋白相比,E2p7前体蛋白与NS2或p7NS2的相互作用显着增强。基于CSFV感染性cDNA克隆pSM反向遗传操作,构建了 E2p7切割功能失活的cDNA克隆pSIM/E2ASG/NSR和p7中心区域缺失的cDNA克隆pSM/△p715-51。病毒拯救分析显示,E2p7切割功能失活或p7中心区域缺失导致无感染性病毒产生。在E2和p7切割位点之间插入核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site,IRES）,构建了双顺反子cDNA克隆pSM/E2/IRES。病毒拯救分析显示,在没有E2p7前体蛋白存在的情况下,仍能有效拯救出CSFV。然而,与感染性cDNA克隆pSM相比,双顺反子cDNA克隆pSM/E2/IRES拯救出的CSFV滴度显着降低,表明E2p7前体蛋白切割产生成熟的E2和p7蛋白为感染性病毒产生所必需,而E2p7前体蛋白的存在能够促进感染性病毒的产生。基于CSFV感染性cDNA克隆pSM反向遗传操作,我们对p7蛋白N末端1-9位氨基酸进行单个位点突变,对p7 N端TM1不同性质的代表性氨基酸进行单个或三个位点突变。病毒拯救分析显示,除p7YFY25/26/30AAA完全阻碍感染性病毒产生外,其它所有位点突变均导致显着降低的感染性病毒产生,表明p7N末端1-9位氨基酸和TM1的氨基酸在调节感染性病毒产生中发挥作用。基于pSM/E2/IRES反向遗传操作,对p7 N末端1-9位氨基酸进行单个位点突变。病毒拯救分析显示,在没有E2p7前体蛋白存在的情况下,这些位点突变不影响或一定程度上调病毒产生,表明p7 N末端氨基酸对感染性病毒产生的调节一定程度上与影响E2p7前体蛋白的切割密切相关。通过构建p7 TM1三个位点突变的真核表达质粒进行Co-IP实验,研究发现p7 突变体如 p7TD118/19/20AAA、p7EVV21/22/23AAA或p7YFY25/26/30AAA与NS2的相互作用显着减弱,表明p7和NS2的相互作用是影响感染性CSFV产生的重要因素之一。为了研究p7在病毒基因组复制中的作用,选取了包含代表性p7突变位点（p7Q5A、p7V8A、p7V9A、p7Y30A、p7TD118/19/20AAA、p7EVV212223AAA）的单顺反子 cDNA 克隆进行基因组复制分析。结果显示,CSFVp7N端氨基酸突变不影响病毒基因组复制,暗示p7调节感染性病毒产生发生在基因组复制后的病毒蛋白加工及病毒粒子成熟阶段。本论文的研究结果有助于加深对猪瘟病毒基因组结构与功能、病毒复制调控和致病机制的理解,对于发展猪瘟防控新策略等有重要意义。
李玲[3]（2015）在《猪瘟病毒新型反向遗传操作技术平台的建立和病毒复制调控研究》文中指出猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）是猪的高致死性、烈性传染病——猪瘟（classical swine fever, CSF）的病原体。猪瘟的发生和流行对猪养殖业造成重大的经济损失。CSFV和牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）、羊边界病病毒（border disease virus, BDV）同属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）。CSFV的基因组为长度约12.3kb的单股正链RNA,包含两端的非编码区（untranslated region, UTR）和中间一个大的开放阅读框（open reading frame, ORF）。ORF编码一个大的多聚蛋白,该多聚蛋白经宿主细胞和病毒编码的蛋白酶水解加工产生具有功能的成熟蛋白,参与完成病毒的生命周期。作为RNA病毒研究的一个重要平台,反向遗传操作技术在CSFV基因组结构功能研究以及疫苗研发等方面具有重要作用。我们利用猪的RNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）启动子驱动细胞内DNA转录产生RNA的特性,构建了一个新型的拯救CSFV反向遗传操作系统。将猪RNA pol Ⅰ启动子序列插入CSFV基因组cDNA的5’末端,鼠polⅠ终止子序列插入其3’末端,成功构建了CSFV石门株和猪瘟疫苗C株的全长cDNA感染性克隆pSPTI/SM和pSPTI/C。CSFV基因组cDNA在宿主细胞内利用细胞pol Ⅰ驱动猪pol Ⅰ启动子起始转录以及鼠的pol Ⅰ终止子终止转录,合成病毒基因组RNA,该vRNA没有5’端加帽修饰及3’poly（A）尾,具有精确的5’UTR和3’UTR末端；同时vRNA可作为mRNA直接翻译、加工得到病毒蛋白。分别将pSPTI/SM和pSPTI/C直接转染PK-15细胞,拯救出相应的CSFV强毒石门株和猪瘟疫苗C株病毒。这种基于polⅠ启动子的反向遗传操作系统能产生具有精确末端基因组的CSFV,且具有更高的拯救效率。以猪瘟疫苗C株的cDNA感染性克隆pSPTI/C为骨架,用强毒石门株UTR替换猪瘟疫苗C株的对应区域,构建获得了嵌合重组病毒株vC/SM 5UTR、 vC/SM3’UTR和vC/SMUTRs。特性研究表明,与猪瘟疫苗C株相比,石门株非编码区替换显着增强了重组嵌合病毒的复制能力,其复制效率由高至低依次为vC/SMUTRs、vC/SM3UTR和vC/SM 5’UTR;且重组病毒在PK-15细胞上形成蚀斑的能力也显示出与其病毒复制效率一致的趋势。嵌合重组病毒在PK-15细胞连续传代后其生长特性保持稳定。CSFV非结构蛋白NS2作为病毒编码的一种自切割半胱氨酸蛋白酶,对NS2-3前体蛋白之间的不完全加工而释放复制复合物关键因子NS3,NS2通过调节NS2-3的切割效率进而调节病毒基因组的复制。为了研究NS2蛋白在CSFV生命周期中的作用,利用反向遗传操作进行特异性位点突变分析,我们重点探讨了NS2 N端跨膜区的结构与功能。结果表明,NS2 N端NS2/D60A, NS2/D60K和NS2/D78K特异性位点突变完全妨碍了CSFV感染性病毒产生；NS2/R100A突变显着降低感染性病毒滴度；NS2/T37A、NS2/K52A、NS2/D78A及NS2/W85A突变不影响产生病毒的能力。通过构建单顺反子复制子研究证实,NS2/D60A、 NS2/D60K和NS2/D78K位点突变导致病毒基因组丧失复制能力,NS2/R100A使基因组复制效率显着降低,NS2/T37A、NS2/K52A、NS2/D78A和NS2/W85A基因组复制效率与野生型一致。表达Rluc活性重组病毒vA187-Rluc和vA187-Rluc/R100A特性分析与复制子结果显示,NS2通过调节病毒基因组RNA复制进而影响感染性病毒的产生。体外NS2-3前体蛋白生化分析结果显示,NS2 N端氨基酸点突变不影响NS2-3的切割效率和NS2-NS2自身的相互作用及蛋白稳定性；双顺反子复制子报告系统分析发现,NS2蛋白对病毒基因组的复制具有负调节作用；NS2氨基酸对基因组复制的调节作用不依赖NS2-3前体蛋白的加工效率。将致死突变体体外转录产物RNA转染细胞,经细胞连续传代获得感染性病毒。全基因组序列分析显示,病毒的恢复在于NS2/D60A和NS2/D60K位点的回复突变或NS2/D78K拟回复突变为NS2/K78E; NS2/R100A突变体的第二位点补偿突变NS2／I90L也导致病毒滴度达到野生型水平,暗示CSFV NS2 N端跨膜结构域之间存在相互作用。我们的研究成果为进一步理解CSFV基因组结构与功能、致病分子机制和发展基因工程疫苗奠定了坚实的基础。
王经满[4]（2015）在《JE疫苗突变株生物学特性及鸭坦布苏病毒流行株基因特征研究》文中进行了进一步梳理日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是人病毒性脑炎的主要病原。JEV可引起严重中枢神经系统损伤的传染病,且病死率较高,JEV同时也是马致死性脑炎的主要病原,还会导致任娠母猪流产、死胎、产弱仔和公猪的睾丸炎以及少数仔猪出现神经症状。JEV是一种自然疫源性病原,自然界中大部分脊椎动物都是其易感宿主,并主要在蚊子和猪之间传播,其中三带喙库蚊是其主要的传播媒介,猪是其主要的贮存和增殖宿主,鸟类也可参与其扩增功能并在环境中参与病毒的长距离传播。JEV是一种单股正链的RNA病毒,是黄病毒属JE血清群的原型病毒,其基因组编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。在病毒蛋白翻译过程中,JEV NS2A基因上的七联滑动体和下游的假结体结构会导致核糖体读码框的-1位移码,进而产生一个NS1衍生蛋白,NS1’蛋白。初步研究表明NS1’蛋白可能与病毒的神经嗜性有关。本研究利用反向遗传技术验证了NS2A基因的第66位核苷酸是JEV表达NS1’蛋白的关键位点之一,同时阐明了NS1’蛋白不能显着增强JE疫苗弱毒株的神经毒力,论证了分泌型NS1’蛋白可以作为检测野毒感染的生物标记。此外,本研究还发现NS1’蛋白能够抑制宿主的IFN-β信号通路的转导。主要研究内容为以下四个部分:1.日本脑炎病毒E279对病毒蚀斑形态和神经毒力的作用研究乙型脑炎是一种由日本脑炎病毒引起的,广泛流行于亚洲各个地区的病毒性脑炎。目前还没有特异性针对乙型脑炎的治疗药物,主动免疫是在人群和易感动物中预防JEV感染的最有效的方法。本研究对商品化的猪乙型脑炎和人乙型脑炎疫苗弱毒株进行评估。结果显示所有商品化疫苗均达到生产要求,JEV RNA拷贝数和病毒滴度均大于105每头份。但是蚀斑形态观察发现四株疫苗的蚀斑大小存在明显差异,两株猪乙型脑炎疫苗弱毒株在BHK-21细胞上蚀斑形态明显偏小。全基因序列分析显示突变主要发生在5’非编码区和E基因,并检测到了几个显性突变位点,而两株猪用疫苗弱毒株仅在基因组1813位有一个共同的显性突变。全基因测序峰图分析发现几个核苷酸位点存在特异性的套峰,说明所检测的病毒在这些位点存在核苷酸的不完全置换。对两株猪用疫苗株的氨基酸序列进行分析,结果显示在E蛋白的铰链区发生了关键位点的突变。通过对疫苗株进行蚀斑纯化,全基因分析以及疫苗回归实验,阐明了JEV的E279由原来的蛋氨酸突变为赖氨酸可以导致病毒在BHK-21细胞上蚀斑形态的变小,论证了在BHK-21细胞上能够显着增加子代病毒的含量。乳鼠攻毒实验表明该位点的突变能够显着增强疫苗株对两周龄乳鼠的神经毒力。本研究发现JE疫苗株在病毒传代过程中容易发生关键位点的突变,为疫苗的安全生产和评估提供了有价值的信息。2.JEV NS1’蛋白在疫苗弱毒株的产生机制及其在病毒感染中的作用研究本研究首先建立了JEV弱毒株SA14-14-2的反向遗传体系,并利用反向遗传技术验证了JE血清群病毒表达NS1’蛋白的分子机制。NS1’蛋白是NS1蛋白在C端延伸52个氨基酸的衍生蛋白,是由于病毒在翻译过程中发生读码框的-1位移码引起的。JE疫苗弱毒株由于基因突变而废除NS1’蛋白的表达。本文通过回复突变NS2A基因的A66G可以恢复病毒NS2A基因的假结体二级结构,促成了读码框-1位移码的发生,并导致NS1’蛋白的表达。但是NS1’蛋白在BHK-21细胞上对病毒的复制效率几乎不产生影响,动物实验表明NS1’蛋白不能显着增强JEV弱毒株SA14-14-2的神经毒力。然而,相对于不表达NS1’蛋白的病毒（rSA14-14-2）,表达NS1’蛋白的病毒（rA66G）能够诱导机体产生更高的获得性免疫应答。此外,NS1’蛋白可以从病毒感染细胞中分泌出来,在受感染动物的血浆中和受感染细胞培养的上清中均能检测到分泌型NS1’蛋白,且NS1’蛋白只以二聚体的形式分泌到受感染细胞外。通过半定量分析发现,分泌到细胞外NS1’蛋白的数量与分泌的病毒粒子呈正相关性。虽然NS1’蛋白与病毒的毒力没有明显相关性,但是相比较JE疫苗弱毒株不表达NS1’蛋白,大部分的流行毒株可以表达NS1’蛋白。因此,分泌型NS1’蛋白可以代替病毒血症作为生物标记区分野毒感染和疫苗接种。3.体外模拟核糖体移码机制及NS1’蛋白的亚细胞分布特征NS1’蛋白是NS1蛋白在C端延伸52个氨基酸的衍生蛋白,是由病毒在翻译过程中发生读码框的-1位移码引起的。本研究通过体外模拟JE血清群病毒核糖体-1位移码机制构建了NS1’蛋白真核表达质粒。并应用真核质粒瞬时转染BHK-21细胞,在转染12h后,就能检测到NS1’蛋白的表达。在转染的早期,NS1’蛋白的表达存在时间依赖关系。真核表达的NS1’蛋白也具有跨膜分泌的特性,也能够形成二聚体的表现形式。对于真核表达的NS1’蛋白进行亚细胞定位发现NS1’蛋白均匀分布于BHK-21细胞的胞浆中,与NS1蛋白在BHK-21细胞内的分布没有明显的差异。4.JEV NS1’蛋白对宿主IFN-β信号通路转导的影响本研究通过双报告基因系统分析JEV NS1’蛋白对IFN-β启动子活性的影响。首先,构建了五个IFN-β启动子活性域测试质粒,并在PK15细胞上检测其基础活性和对POLY（I:C）刺激的反应性。测试结果显示,缺失IFN-β启动子活性域Ⅰ/Ⅲ和Ⅱ的两个测试质粒是失活性缺失,其几乎不存在基础活性,对POLY（I:C）刺激的反应性较低。而未缺失IFN-β启动子活性域或缺失活性域Ⅳ,以及串联4个活性域Ⅰ/Ⅲ的测试质粒均有较高的基础活性,且对POLY（I:C）刺激具有良好的反应性。通过与测试质粒共转染PK-15细胞,发现NS1’蛋白能够抑制POLY（I:C）刺激后IFN-β启动子活性。并对其基础活性也能产生一定的抑制作用。此外,NS1’蛋白几乎不能抑制真核表达的IRF7刺激后IFN-β启动子活性。通过间接免疫荧光实验证明了NS1’蛋白在PK-15细胞上能够有效抑制POLY（I:C）刺激后NF-κB的入核作用。通过病毒感染模型,阐明了在干扰素应答的宿主细胞内,NS1’蛋白能够有效增加JEV的mRNA水平,并在感染早期抑制IFN-β的mRNA水平。通过免疫共沉淀和质谱分析发现在干扰素应答的宿主细胞内,NS1’蛋白可能与热应急蛋白、Vimentin和TRIM21发生相互作用,进而抑制宿主的先天性免疫反应。5.鸭坦布苏病毒流行株的全基因特征研究鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）是一种可引起鸭产蛋量下降、采食量锐减,并导致部分感染鸭死亡的蚊虫传播的黄病毒。2011年,对我国安徽地区鸭坦布苏病毒进行流行病学调查,从感染鸭群中分离出一株鸭坦布苏病毒（DTMUV-AH2011）。通过序列测定和全基因分析显示,DTMUV-AH2011分离株全基因为11,064nt,含有一个10,278nt的开放式阅读框,在开放式阅读框的5’端有94nt的5’NTR,开放式阅读框的3’端有692nt的3’NTR。与其他5株坦布苏病毒全基因相比,DTMUV-AH2011分离株的3’NTR有74nt的插入序列。通过对病毒编码蛋白氨基酸序列比对发现,近年来国内分离的所有坦布苏病毒均含有相对保守的多聚蛋白前体,氨基酸同源性在98.9%以上。除了NS4B蛋白没有氨基酸置换外,其余蛋白均有氨基酸的随机置换。对鸭坦布苏病毒的生物学特征和3’NTR插入基因的潜在功能分析,有利于进一步的了解病毒的复制和致病机制。
范宝超[5]（2015）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞和中和抗体的功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析》文中提出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是造成世界养猪业重大经济损失的主要病原之一。病毒基因存在较大变异。PRRSV感染可以引起免疫抑制,导致持续性感染,而宿主所产生的获得性免疫反应可作为病毒的选择性压力,在病毒基因进化过程中发挥重要的作用。但目前对PRRSV免疫抑制和免疫逃逸的机制尚不十分清楚。本研究从我国中部某发病猪场发现GP3部分基因缺失的PRRSV毒株。通过单核衍生树突状细胞（MoDCs）与外周血淋巴细胞（PBMCs）的共培养方法,确定高致病性PRRSV（HP-PRRSV）毒株较传统毒株（C-PRRSV）诱导调节性T细胞（Tregs）的能力更强,并发现PRRSV N蛋白的15N和46R两位氨基酸酸（aa）在诱导Tregs中起重要作用。同时,通过病毒体外中和抗体下连续传代获得抗性毒株,采用中和抗体试验和cDNA感染性克隆技术,发现GP5蛋白第102和104位aa,及M蛋白第70位aa为诱导PRRSV中和抗体的关键位点,对阐明PRRSV免疫抑制机制和PRRSV抗原变异监测有重要意义。主要研究内容分为以下4个部分:1.我国出现新的PRRSV GP3部分基因缺失毒株本研究于2012年我国上海市某规模猪场患病仔猪中分离获得一株PRRSV,命名为SH1211。全基因组测序结果显示,除去3’端多聚腺苷酸尾巴（Poly:A）,该毒株基因组全长15,313个碱基。与HP-PRRSV毒株JXA1的基因同源性达94.9%。ORFs推导的aa与美洲型PRRSV毒株相比,SH1211毒株GP3第68和69缺失两位aa;GP2和GP5与JXA1相应蛋白的同源性分别为91.5%和85.1%。进化树分析表明,SH1211全长与我国HP-PRRSV分离株距离最近,其中,GP2和GP5与QYYZ毒株距离最近。基因重组分析表明,SH1211为JXA1和QYYZ的重组毒株,重组位置位于GP2和GP5基因编码区域。因此,SH1211是一株具有明显变化的新型PRRSV毒株,丰富了该病毒流行病学资料。2.PRRSV诱导Tregs功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析本研究首先建立了外周血单核细胞衍生树突状细胞（MoDCs）培养方法和CD4+CD25+Foxp3+ Tregs的检测方法;然后通过不同毒力的美洲型PRRSV毒株体外感染MoDCs和淋巴细胞的共培养系统,经测定发现,HP-PRRSV毒株较C-PRRSV诱导Tregs能力更强,并且其诱导产生的Tregs具有抑制PHA刺激的同源淋巴细胞增殖的能力。为了探索PRRSV诱导Tregs的功能蛋白,我们采用杆状病毒表达系统获得HP-PRRSV毒株纯化重组GP5、M和N蛋白,结果证明只有N蛋白具有诱导Tregs的能力。然后通过使用覆盖N蛋白全长的16条合成肽,进行Tregs诱导试验,发现N蛋白中3个aa区域15-21、42-48和88-94在诱导Tregs中起重要作用。最后利用HP-PRRSV感染性cDNA克隆获得的点突变重组病毒,确定N蛋白的15N和46R残基为诱导Tregs的关键位点,并且Tregs的表型与分泌TGF-β的Th3型Tregs非常相似。该研究对阐明PRRSV感染的免疫机制作用有重要意义。3.PRRSV诱导中和抗体功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析本研究采用HP-PRRSV BB0907毒株在PRRSV中和抗体血清（NAb）环境中连续传代,经蚀斑纯化获得5株抗性毒株BB5s、BB10s、BB20s、BB30s和BB34s,且BB34s的中和滴度显着降低。经测序发现该毒株结构蛋白区域发生9个aa突变,分布于 GP2（G198V）、GP3（P69S、K71R 和 S226P）、GP4（D43N 和 F44S）、GP5（Y102C和G104R）和M（R70K）。为确定上述aa突变对抗体中和作用的影响,利用HP-PRRSV感染性cDNA克隆获得含有相应点突变的重组病毒,经中和试验确定,GP5蛋白的第102和104位aa、M蛋白的第70位aa为HP-PRRSV NAb作用的关键位点。并且aa序列比对发现,GP5的Y102C和G104R,以及M的R70K变异频繁存在于美洲型PRRSV毒株之中。最终,本研究确定GP5蛋白第102和104位aa,及M蛋白第70位aa为PRRSV NAb作用的关键位点,并且上述位点aa的改变调节了 PRRSV对NAb中和作用的敏感性。4.HP-PRRSV对高原藏香猪的致病性研究藏香猪是一种特殊类型的猪种,对HP-PRRSV易感性尚未见报道。本研究我们在高原地区,选择15头PRRSV阴性的4周龄藏香仔猪,随机分为3组,每组5头。第1组滴鼻接种HP-PRRSV毒株BB0907;第2组与接种猪（第1组感染猪）接触饲养2天后分开;第3组为空白对照组。所有组隔离饲养观察14天。结果为:攻毒组和接触组仔猪第3-5天体温达40.0。C以上,并出现精神沉郁、厌食、嗜睡、眼睛有粘性分泌物和后肢麻痹等症状,死亡率分别为80%和40%,主要病变为间质性肺炎。感染后4-14天出现病毒血症;感染仔猪的血清、肺部灌洗液和淋巴结组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等细胞因子显着升高,证明HP-PRRSV毒株对藏香猪有较强致病作用,加强我国高原地区PRRSV预防和控制十分必要。
李维克[6]（2014）在《犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建》文中研究说明犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）引起的犬科和其它肉食动物一种重要传染病,在全世界范围内广泛分布,常常给养犬业和毛皮动物养殖业造成严重的危害。近年来,CDV的宿主动物范围呈现逐步扩大的趋势,几乎囊括大多数肉食动物,严重影响着野生肉食动物的种群数量,引起了国内外学者的广泛关注。反向遗传操作（Reverse genetic）是20世纪90年代后期出现的新型病毒学技术,其主要是通过对病毒基因组cDNA操作而获得具有活性的病毒粒子的过程。反向遗传操作的发展和成熟,为不分节段的单股负链RNA病毒（Non-segments negative strand RNA virus, NSNSY）的病毒学基础和应用研究提供了技术手段。采用反向遗传操作系统可对病毒基因组cDNA进行定点突变、缺失或外源基因插入修饰,从而拯救获得相应的突变、重组病毒。目前,在我国已经建立了几株CDV弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,但仍未能建立野生型强毒株的反向遗传技术平台,制约着犬瘟热病毒在宿主动物体内扩散与分布及其分子致病机制等方面的研究。因此,CDV强毒株反向遗传操作系统的建立具有重要的意义。本研究以2008年从自然感染死亡的藏獒病料中分离获得的CDV强毒株TM-CC为亲本株,进行全基因组序列测定,在此基础上构建了含有TM-CC株病毒基因组全长cDNA克隆的重组真核表达质粒pCI-CDV-TM-CC和分别表达TM-CC株病毒N、P、L蛋白基因的重组真核表达质粒pCI-CDV/NP、pCI-CDV/P和pCI-CDL/L。同时,构建了表达犬信号淋巴细胞激活因子（Signaling lymphocyte activation molecules, SLAM）基因的重组真核表达质粒pCAGG-dogSLAM。然后,采用磷酸钙转染的方法将上述5种质粒共转染BSR细胞,成功拯救出重组病毒,命名为rCDV-TM-CC。该重组病毒与亲本株相比,二者的生长特性基本一致,在表达犬SLAM受体的VerodogSLAM细胞上的生长曲线相似,病毒滴度达到峰值的时间相同,最高病毒滴度相近,分别为10694TCID50/mL和10678TCID50/mL。结果表明,本研究成功构建了CDV强毒株TM-CC的反向遗传操作系统,为开展犬瘟热病毒的病毒学基础研究提供了工具平台。为今后开展CDV强毒株病毒在动物机体组织中的扩散与分布和致病机制方面的研究,在重组质粒pCI-CDV-TM-CC的基础上,将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, EGFP）基因插入到犬瘟热病毒H和L基因之间,构成含有EGFP基因的TM-CC株病毒基因组全长cDNA克隆质粒pCI-CDV-TM-CC-EGFP,从而拯救并获得了表达EGFP基因的重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP。重组病毒rCDV-TM-CC-EGFP基本保持了亲本株rCDV-TM-CC的生长特性,在VerodogSLAM细胞上的生长动力学曲线与亲本株rCDV-TM-CC基本相似,最高病毒滴度可达106.56TCID50/mL。该重组病毒在VerodogSLAM细胞上具有良好的生长特性和遗传稳定性,在VerodogSLAM细胞上连续传代20代次后,仍能稳定、高效的表达EGFP。以重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP表达的EGFP作为目的蛋白的检测方法与传统的犬瘟热病毒检测方法相比,更为敏感、特异、方便,为CDV强毒株在动物体内、外扩散及致病机制研究提供了技术手段。本研究成功建立了CDV强毒株TM-CC的反向遗传操作系统,并在此基础上成功构建了表达EGFP基因的重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP,为开展犬瘟热病毒的病毒学基础研究提供了工具平台和技术手段。另外,犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）引起的犬科、鼬科等肉食性动物的一种急性接触性传染病,严重威胁着养犬业和皮毛动物养殖业的发展。目前我国使用的犬细小病毒病疫苗以灭活疫苗为主。然而,灭活疫苗接种动物诱导的CPV中和抗体反应持续时间较短,且生产成本较高。因此,研发更加安全、有效、成本低廉的犬细小病毒病疫苗仍具有现实意义。本研究以我国生产实践中使用的犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R-20/8为活病毒疫苗载体,在其P和M基因之间的非编码区插入CPV VP2蛋白基因,从而成功救获表达CPV VP2蛋白基因的重组CDV弱毒疫苗株rCDV/R-20/8-CPVVP2。间接免疫荧光试验和Western blotting结果表明CPV VP2蛋白在重组病毒rCDV/R-20/8-CPVVP2感染的细胞中获得正确表达。同时,重组病毒rCDV/R-20/8-CPVVP和亲本毒株CDV/R-20/8相比,二者的生长特性基本一致,在Vero细胞的生长曲线相似,病毒滴度达到峰值的时间相同,最高病毒滴度分别可达10581TCIDso/mL和106.89TCID50/mL。该重组病毒的构建为防制犬瘟热和犬细小病毒病二联活载体疫苗的研制奠定了基础。
陈建飞[7]（2012）在《猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建》文中研究指明猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是冠状病毒的成员之一，能够引起各年龄的猪发生呕吐、腹泻和脱水，尤其是1周龄内的新生仔猪。新生仔猪的发病率和死亡率可达100%。该病毒给我国的养猪业造成了严重的经济损失。PEDV弱毒株（CV777-P125）、强毒株CH/S、流行毒株CH/FJND-3/2011全基因组序列的长度分别为27953个核苷酸（nucleotides, nt）、28026nt、28038nt。CV777-P125、CH/S、CH/FJND-3/2011全基因组序列与CV777的同源性分别为97.6%、97.2%、96.9%。CH/S、CH/FJND-3/2011与CV777-P125的序列同源性分别为97.7%、97.2%。CH/S与CH/FJND-3/2011的序列同源性为97.4%。CV777-P125、CH/S、CH/FJND-3/2011的5’非编码区（Untranslated region, UTR）由292nt组成，比CV777的少4nt。与CV777相比，CV777-P125在复制酶基因内缺失24nt、在S基因内缺失3nt、在ORF3内缺失49nt； CH/S在复制酶基因内缺失3nt；CH/FJND-3/2011在S基因内有碱基缺失和插入现象，导致S基因比CV777的长9nt。2011年27株地方流行毒株（包括CH/FJND-3/2011）S基因的长度在41464170nt之间，其中17株的长度为4161nt。根据S基因的系统发育树：27株流行毒株和33株参考毒株被分为2个大群（G1、G2）；每个大群又分为2个亚群（G1-1、G1-2、G2-1、G2-2）。有17株在G1-1亚群中，和韩国2009年流行毒株的亲缘关系较近；3株在G2-1亚群中，和JS-2004-2, DX, LJB/03的亲缘关系较近；7株在G2-2亚群中，和弱毒株的亲缘关系较近。S基因序列分析结果表明：G1-1亚群内的17株毒株的S基因除存在碱基缺失和插入外，还存在大量的点突变。碱基缺失、插入和点突变主要集中在S基因N端的1100nt内部。G2-2亚群内的流行毒株与PEDV弱毒株的同源性较高，G2-1亚群内的次之，G1-1亚群内的最低。CV777-P125、CH/S、2011年流行毒株S蛋白上诱导中和抗体产生的抗原表位域（COE）、抗原表位（S1D5，S1D6，2C10）与CV777S蛋白上相应区域分析结果表明：29个毒株的COE序列没有氨基酸缺失和插入，但是存在氨基酸点突变，突变数目为713个；2011年流行毒株与CV777-P125的点突变氨基酸数目为08个，突变率在0%5.71%。S1D5表位除在CH/HLJHG/2011中有1个点突变外，在其他流行毒株中则完全保守；S1D6表位在CV777-P125、CH/FJND-4/2011、CH/GXNN/2011、CH/GXWM/2011、CH/HNZZ/2011、CH/JL/2011中完全保守；而在其他毒株中则有2或3个点突变；2C10表位在所有毒株中非常保守。构建了含巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）早期启动子序列、PEDV5’端序列（402bp）、多克隆位点序列（SacII、MluI、NarI）、PEDV3’端序列（2434bp，含多聚腺苷化尾巴）、丁型肝炎病毒（hepatitis delta virus, HDV）核酶序列、牛生长激素（bovine growth hormone, BGH）终止和多聚腺苷化序列6个元件的中间质粒pBAC-PEDV-5’-3’。通过融合PCR得到构建全长cDNA克隆的4个片段（AB、C、D、E）。将4个片段依次连接到中间质粒pBAC-PEDV-5’-3’上，得到含全长cDNA克隆的重组质粒pBAC-PEDV-FULL。用该重组质粒转染Vero E6细胞拯救重组病毒，重组病毒能够引起Vero E6细胞发生病变，套式RT-PCR能够检测到重组病毒F2代的正链和负链RNA；通过电镜能够检测到重组病毒F5代的病毒粒子，F5代的5’端序列与重组质粒pBAC-PEDV-FULL、亲本毒株的同源性分别为99.9%、99.6%。利用引入的分子标签能够对重组病毒和亲本毒株进行鉴别诊断。上述结果表明我们已经成功构建了PEDV感染性cDNA克隆。
曾艳丽[8]（2012）在《1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立》文中研究表明研究背景和目的丙型肝炎病毒（HCV）引起的急、慢性肝病表现为很宽的临床谱,从症状轻微到肝功能衰竭,慢性丙型肝炎患者有20%-30%在10-30年后将进展为肝硬化甚至肝癌。目前全球约有一亿八千万人口感染HCV。HCV的流行率高,慢性化率高,抗HCV筛查不能可靠的避免其经输血途径传播,又无疫苗预防。丙型肝炎治疗的关键是抗病毒治疗,国际上公认的治疗方案为：聚乙二醇化干扰素（PEG-IFN）联合利巴韦林,平均持续病毒学应答率（SVR）为56%左右。研究发现不同的基因型抗病毒治疗方案、疗程不同,且抗病毒治疗的应答率也存在差异。如HCV1b型患者应用PEG-IFNa与利巴韦林（1000mg/d）联合治疗至少需要48周,SVR约为15%-50%；HCV2/3型患者应用PEG-IFNa与利巴韦林（800mg/d）联合治疗仅仅需要24周,SVR约为80%。我国主要的HCV流行基因型为1b型,但值得注意的是,即使均为HCV1b型感染者,对干扰素治疗的结果也可截然不同。部分HCV1b型患者经抗病毒治疗后可达到SVR甚至痊愈,另一部分则疗效极差。虽然近期两个新型的蛋白酶抑制剂Boceprevir和Telaprevir已经被批准用于临床,但其远期疗效还有待评价。因为HCV感染呈现慢性、隐匿的特点,随着病程的进展,丙肝相关性终末期肝病患者的数量在未来二十年内将继续增长,迄今仍是世界性的医学、社会难题和经济负担。为何部分HCV1b型患者对抗病毒治疗反应良好,能够痊愈,另一些则反之?究竟哪些因素与丙型肝炎患者抗病毒治疗疗效预测的关系密不可分?如何更有效、更合理地使用干扰素进行抗病毒治疗、提高丙肝抗病毒治疗的疗效?这是目前慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗研究的热点和难点。HCV是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科,全长约9.6kb,包括一个大的开放阅读框及两侧的5,和3’非编码区,可以编码约3000个氨基酸的前体多聚蛋白。翻译后,前体多聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成10个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分为结构蛋白（C、E1、E2、p7）和非结构蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。因为HCV所依赖的RNA聚合酶缺乏校正功能,其基因组序列呈高度异质性,不同的分离株在全基因序列上差异达30%-35%。一直以来,由于缺乏实用的动物模型和有效的HCV体外细胞培养系统,严重影响了HCV复制机制、疫苗研制及新HCV防控策略的研究。1999年,HCV体外细胞培养研究取得了阶段性进展,Lohmann等构建了带新霉素磷酸转移酶基因作为筛选标志的HCV亚基因组（删除了结构基因,从C到NS2及P7）复制子,这是一个双顺反子结构,第一个顺反子由HCV IRES引导,第二个顺反子（NS2-5B）由插入的脑心肌炎病毒（EMCV） IRES引导。用体外转录的RNA转染Huh7细胞,在硫酸新霉素（G418）的筛选下,获得了少数细胞克隆。复制子刚转染细胞后,其复制子水平较低,随着不断传代,其RNA复制水平明显提高,经序列分析表明高复制的复制子发生了较多的适应性突变。经实验证实,重要的适应性突变有10余处,散布于整个多蛋白编码区,尤其以表达病毒RNA聚合酶的NS5A区较集中,且不同的适应性突变具有协同效应。适应性突变是复制子在特定细胞内培养取得成功的关键之一,它通过增强宿主细胞活化分子与其结合以及去除细胞抑制因子与其相互作用而有利于复制子的复制和表达。随后,一些其他基因型的HCV复制子,如HCV1a （H77）、2a （JFH1）等复制子均被报道。复制子部分揭示了HCV与宿主细胞间复杂的相互关系,对HCV的基础研究和抗病毒药物筛选具有重要意义,特别是在新的抗HCV药物如NS3与NS4蛋白酶抑制剂、NS5B多聚酶抑制剂的研发中的发挥了重要作用。然而由于不含结构基因,非结构基因复制子在细胞培养系统中不能产生完整的HCV颗粒,难以满足深入研究HCV生物学特点、特别是针对结构基因的保护性抗原的鉴定和疫苗研制,以及全方位筛选抗病毒药物的需要。因此,很多研究者致力于建立一个可以产生感染性HCV病毒颗粒的细胞培养系统。2005年,Wakita等、Zhong等和Lindenbach等分别成功地建立了HCV2a型全长基因体外细胞培养系统。而且由此产生的病毒颗粒可在细胞内连续传代而感染性不会减低,获得了稳定的、可产生高效感染性病毒颗粒的体外细胞培养系统。在此基础上,HCV细胞培养技术取得了突飞猛进的发展并广泛的应用于相关研究中。虽然近年来这些方面的研究有很大进展,但是仍然有很多亟待解决的问题。目前已经建立的有效地HCV体外培养系统,基本都是在JFH1（2a型）毒株的基础上发展起来的,而我国丙型肝炎的主要流行毒株是1b型,与国外建立的细胞培养系统所用的HCV基因型不同。HCV1b型全基因细胞培养系统难点较多,研究进展较缓慢,但不少学者也在此方面做了很大努力。2005年Heller T等构建了HCV1b基因型全长cDNA,两端加有核酶后克隆至真核表达载体,转染Huh7.5细胞,可以检测到病毒的复制,蛋白的表达,并能够获得感染性病毒颗粒,但是该系统产生的病毒颗粒感染性很不理想。国内一些学者将含1b型HCV全长cDNA的重组质粒和高效表达T7RNA聚合酶的vTF7-3共转染细胞,通过vTF7-3表达T7RNA聚合酶的辅助作用,可使细胞高效产生HCV RNA,并发现病毒颗粒的产生。但该系统生产的重组HCV颗粒中含有痘病毒的污染,给病毒颗粒的分离纯化带来不便,且vTF7-3也有一定的细胞毒性,在以痘病毒为辅助病毒的体系中,细胞很快死亡,故在每次培养HCV是,都须重复进行细胞培养、转染重组质粒和感染痘病毒等操作,过程繁琐,实验安全性也存在一定的隐患。此外,这两个体系都需要辅助质粒或重组病毒提供凡是启动子激活物和加工因子,HCV核酸的初始复制也非RNA病毒复制的自然状态,而是以质粒DNA为模板的转录,故最为HCV复制机制和抗HCV药物的筛选平台,其作用受到限制。至今,国内尚未见到关于HCV1b型细胞培养系统完全成功的报道。本研究旨在通过HCV完整半基因组扩增测序的方法分析病毒基因变异对PEG-IFN联合利巴韦林治疗1b亚型慢性丙型肝炎疗效的影响,试图阐明病毒基因组变异对干扰素疗效方面发挥的作用；并在此基础上,用已发生适应性突变的HCV1b复制子来插入HCV1b结构基因以建立我国流行株1b型全基因HCV细胞培养系统,为我国丙型肝炎发病机制的研究,HCV结构基因中保护性抗原的鉴定及疫苗的研制、研发抗HCV新药和新疗法、高通量筛选已见临床疗效的药物、药物单体,探索新的联合用药方案以提高疗效,并阐明疗效机制提供良好的平台。第一章HCV5’端半基因组的扩增及其序列变异对PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC疗效的影响研究方法收集慢性丙型病毒性肝炎患者治疗前血清标本,纳入研究的61例患者诊断符合《丙型肝炎防治指南》抗病毒治疗标准,所有患者均为1b型HCV病毒感染,并完成PEG-IFN联合RBV抗病毒治疗48周且随访24周,其中获得持续性病毒学应答（SVR组）的患者35例,未获得持续性病毒学应答（Non-SVR组）的患者26例。采用长片段RT-PCR法扩增包括完整核心蛋白至NS3蛋白的HCV5’端5.2kb半基因组序列,测序后分析病毒基因组序列变异与抗病毒疗效之间的关系。统计学分析：计量资料采用独立样本t检验,计数资料采用X2检验；SVR组和Non-SVR组总氨基酸变异个数和特异性氨基酸变异个数的比较采用Mann-Whitney U检验；而特异性变异占总氨基酸变异的百分比使用X2检验。两组熵值的比较采用Mann-Whitney U检验；平均基因组距离采用独立样本t检验。P值小于0.05时有统计学差异,所有统计学分析使用SPSS13.0软件。结果中国患者治疗前HCV的氨基酸变异情况可以影响PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC的疗效。我们分别比较了两组患者1b型HCV半基因组氨基酸变异总数和特异性氨基酸变异情况,中国CHC患者治疗前体内病毒氨基酸的变异性与抗病毒疗效相关,且氨基酸变异主要集中在p7,NS2和NS3蛋白。SVR组患者P7、NS2和NS3蛋白的特异性氨基酸变异个数（P=0.036,P<0.001和P=0.006）、特异性氨基酸变异的比例（P<0.001,P<0.001和P<0.001）、熵值(（P=0.019,P=0.023和P=0.046）以及基因组距离(（P<0.001,P<0.001和P=0.011）均显着高于Non-SVR组。第二章HCV1b replicon细胞培养系统的建立研究方法我们以两个获赠的1b复制子质粒为基础,构建在Huh7.5.1细胞内能够长期、稳定、高拷贝复制的亚基因组复制子细胞培养系统。其一是1b-G复制子质粒,该复制子含有HCV Conl分离株NS3-NS5B非结构基因的cDNA序列,在NS5A区含S2204I适应性突变。其二是lb-H复制子质粒,该复制子与1b-G相比,在新霉素抗性基因的上游插入了一个荧光素酶报告基因以方便检测,且其适应性突变位于NS3区的E1202G和T1280I,以及NS4B区的K1846T。具体方法是,将Scal酶切的线性化1b-H复制子和1b-G复制子质粒为模板,在T7RNA聚合酶的作用下,体外转录出复制子RNA,然后将此RNA转染至Huh7.5.1细胞,以含800μg/ml G418的培养基进行筛选,根据克隆形成情况对克隆进行分离培养,然后用RT-PCR、间接免疫荧光、Western Blot和荧光素酶检测等方法对克隆细胞中的HCV核酸和蛋白进行检测。结果用1b-H和1b-G复制子转染Huh7.5.1细胞后,都获得了G418抗性克隆,并在最终分离出的细胞克隆中,检出HCV复制子特异性的RNA和NS5A蛋白。由于lb-H复制子中含有荧光素酶报告基因,我们通过检测报告基因的表达活性来分析病毒的复制水平,代替繁琐的RT-PCR和Western Blot检测方法,较好地方便了实验研究。第三章我国N型肝炎流行株1b型全基因HCV细胞培养系统的建立研究方法选取两例“难治性丙肝”患者血清,扩增HCV5’端半基因组序列并构建克隆,选取15-20个克隆进行测序分析病毒准种的优势株；选取优势克隆株质粒,通过重叠延伸PCR的方法引入合适的酶切位点,再通过酶切连接的方法,以完整的Core-NS2区基因替换复制子中的外源性基因序列,从而构建HCV1b全长cDNA重组质粒；然后将全长cDNA克隆经Scal酶切线性化,在T7RNA聚合酶作用下体外转录制备全长HCV RNA,并转染Huh7.5.1细胞,荧光定量RT-PCR检测细胞上清和细胞内HCV RNA, Western Blot方法检测病毒蛋白的表达,间接免疫荧光法检测病毒蛋白的表达以及含病毒细胞上清的感染性。结果本研究在lb replicon的基础上,将来源于中国患者血清病毒的完整结构基因（core-p7）和部分非结构基因（NS2及NS3）插入复制子,成功构建了四个不同的1b型HCV全长cDNA克隆。将这些1b型HCV RNA转染Huh7.5.1细胞后,虽然未能成功建立感染性细胞培养系统,却能检测到低水平的病毒RNA的复制。经比较后发现,我们构建的1b-H-P2、1b-H-80和1b-G-P2、1b-G-80在非结构基因区适应性突变的不同导致它们RNA复制水平有所不同,在一定程度上也说明不同的适应性突变位点之间存在协同作用。结论本研究表明中国患者治疗前HCV的氨基酸变异情况可以影响PEG-IFN/RBV治疗1b亚型CHC的疗效,氨基酸变异主要集中在p7,NS2和NS3蛋白。完整扩增HCV5’端半基因组为构建HCV全长细胞培养系统打下了基础,并且序列分析的结果为HCV蛋白与干扰素抵抗的体外研究实验提供了线索。同时我们成功建立了针对我国人群易感染的HCV lb亚型体外复制子的细胞模型,不仅为本实验室HCV致病机制的研究及对抗病毒药物的评价提供了一个新的途径,也为下一步建立1b型HCV全长细胞培养系统提供了一个良好的技术平台。在1b-H和1b-G复制子的基础上,我们成功构建了4个1b型HCV全长cDNA质粒,虽然未能成功建立感染性细胞培养系统,却能检测到低水平的病毒RNA的复制。分析原因,可能是由于病毒在装配和释放的过程中,某些环节存在未能阐明的问题,导致产生的病毒颗粒感染活性低下；也可能是因为所构建的cDNA还存在某些缺陷,不能产生完整的病毒颗粒。为了排除后一种原因,我们使用已经明确在痘病毒辅助系统辅助下能有效复制并产生感染性病毒颗粒的1bHCV cDNA为模板,重新构建1b型HCV全长cDNA,转染细胞后仍然未能获得感染性病毒颗粒。此结果表明,我们构建的1b型全长cDNA不具有感染性与基因序列缺陷无关。病毒在细胞中能否成功复制与装配,是病毒与细胞相互选择的结果,但细胞环境复杂,蛋白与细胞因子众多,因此影响1b型HCV感染性细胞培养系统成功建立的因素有待进一步研究。
张羽[9]（2011）在《日本脑炎病毒NJ2008株人工突变致弱及其N-糖基化位点的功能研究》文中研究表明日本脑炎（Japanese Encephalitis, JE）,又称流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B）,是由日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病,与西尼罗病毒（West Nile Virus, WNV）和登革热病毒（Dengue Virus, DENV）等同属于黄病毒科黄病毒属。JEV在鸟与蚊子之间有一个区域性传播循环,猪作为中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。该病对养猪业的危害主要表现为夏秋季节母猪的繁殖障碍与公猪的睾丸炎,在我国流行面积较大,近年来经济损失较为严重,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。由于现阶段对于乙脑尚无治疗的特效手段,因此预防乙脑的发生尤为重要,而疫苗是控制该病发生的最佳手段。寻求稳定、安全的猪用乙脑疫苗,已经成为近年JEV感染防治的主要研究方向。反向遗传操作（又称感染性克隆）为在DNA水平上研究RNA病毒的基因组结构及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段,进而深入研究RNA病毒的本质和开发新产品。自反向遗传操作技术在乙脑病毒上应用以来,在对乙脑病毒致病机理、分子表达调控机制、细胞生长特性、毒力决定基因、疫苗研制等方面的研究已取得明显进展。本研究构建了两个突变感染性克隆株（突变E138、N154）分别在细胞和动物模型上验证其毒力的变化,为猪源乙型脑炎病毒减毒活疫苗的研制提供了一个良好平台；同时构建突变N154的重组真核质粒,通过其对小鼠细胞免疫水平、体液免疫水平以及免疫保护力的检测,评价其作为改良核酸疫苗的潜能。研究主要从以下几方面展开：1猪源乙型脑炎病毒NJ2008株全基因克隆及序列分析猪源乙型脑炎病毒NJ2008株是从南京某猪场流产胎儿的脑组织中分离并在BHK-21细胞上经数次传代,本实验根据乙型脑炎病毒SH0601株的基因组序列设计并合成JEV特异性引物进而应用RT-PCR技术分11段扩增了JEV NJ2008株基因,将所得片段克隆至pMD18-T载体上,经测序后获得了JEV基因组全序列。序列分析表明,该JEV基因组全长10,961bp,含有一个大的开放阅读框架,编码由3432个氨基酸残基组成的聚合蛋白,其5’非编码区（5’UTR）和3’非编码区（3’UTR）分别由95和578个碱基组成,与其它毒株比较发现3’非编码区（3’UTR）的44bp处共缺少16个碱基。通过全基因和E基因的进化树分析可得,猪源乙脑NJ2008株病毒属于基因Ⅲ型,该病毒的全基因与其它32株病毒核苷酸进行比较发现,同源性在99.4%和88%之间,与其它45株病毒E蛋白的核苷酸比较发现,同源性在99.2%和87.7%之间；该病毒的全基因与其它32株病毒氨基酸进行比较发现,同源性在99%和89.1%之间,与其它45株病毒E蛋白的氨基酸比较发现,同源性在99.5%和89.7%之间,突变位点分散于各个区域。与其它16株猪源乙脑病毒E蛋白的氨基酸比较发现,E蛋白的309位氨基酸发生了突变,由酪氨酸（Tyr）-丝氨酸（Ser）,并且307-309位为乙型脑炎病毒E蛋白的一个B细胞线形表位。2猪源乙型脑炎病毒NJ2008株感染性克隆的构建及鉴定本实验根据猪源乙型脑炎病毒NJ2008株基因组序列设计并合成JEV特异性引物,进而应用RT-PCR技术分4段扩增了JEV NJ2008株全基因组cDNA。将扩增的1、2两个片段通过重叠PCR的方法扩增出JEV 5’cDNA,将扩增的3、4两个片段通过重叠PCR的方法扩增出JEV 3’cDNA。在扩增5’前端时,引入T7启动子序列用于后期的体外转录得到病毒的转录本,在基因组5’前端和3’末段分别引入SalⅠ和KpnⅠ酶切位点,最后将5’cDNA和3’cDNA连入pBluescriptⅡKS载体,构建的质粒命名为pSK-SUP、pSK-HYP。进一步的酶切鉴定及接头处序列测定的结果表明,成功获得了NJ2008株基因组全长cDNA克隆。用SalⅠBamHⅠ双酶切质粒pSK-SUP,用BamHⅠ、KpnⅠ酶切已经构建好的质粒pSK-HYPO,然后通过体外连接获得全长基因组。体外连接的全长基因组转录合成病毒RNA,转染BHK-21细胞,72h后将转染病毒RNA细胞冻溶1次后接种BHK-21细胞,拯救出病毒。通过间接免疫荧光证明病毒拯救成功,并且比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,发现病毒学及分子生物学特性没有显着差异。通过测序分析,拯救病毒的氨基酸与亲本毒共有3个氨基酸的差异,尚没有文献报道该病毒的毒力与这3个氨基酸有关。以上结果表明JEV强毒株NJ2008株感染性克隆构建成功,建立了JEV疫苗株的反向遗传操作系统,为研究JEV的分子生物学以及致病机制提供了技术平台。3猪源乙脑病毒E138位突变株感染性克隆的构建与病毒拯救日本脑炎病毒E蛋白的138位氨基酸对于该病毒的毒力强弱起到至关重要的作用,所以本研究以乙脑病毒NJ2008株全长感染性克隆为亲本,利用反向遗传技术将该病毒的E蛋白138位谷氨酸（Glu）突变为赖氨酸（Lys）,构建了突变株的全基因感染性克隆。将其转染乳仓鼠肾细胞（BHK-21）,72h后出现病变,并在BHK-21细胞中盲传3代,通过病毒蚀斑形成试验、间接免疫荧光和荧光定量RT-PCR等方法与亲本感染性克隆株对比分析其感染性的差异。结果表明,突变病毒的蚀斑数和荧光数明显比亲本株少,在感染2-3d后,细胞内病毒RNA的量大约是亲本株的1/3。另外,在小鼠脑内接种同剂量的亲本株病毒和E138突变感染性克隆病毒,接种E138突变感染性克隆病毒株的小鼠的致病力大大降低。该实验将为猪源乙型脑炎病毒减毒活疫苗的研制提供了一个良好平台。4猪源乙脑病毒NJ2008株N-糖基化位点的突变影响病毒的复制、胞内定位以及致病力日本脑炎病毒E蛋白仅含有一个糖基化位点,N154-N-T。已经有文献报道,有些病毒E蛋白糖基化位点的改变会影响病毒的形态、感染力以及免疫应答,但乙型脑炎病毒该位点的突变是否影响病毒的感染力或致病力尚不清楚。所以本研究以乙脑病毒NJ2008株全长感染性克隆为亲本,利用反向遗传技术将该病毒的E蛋白154位天冬酰胺（Asn）突变为丙氨酸（Ala）,构建了N154突变株的感染性克隆。将其转染乳仓鼠肾细胞（BHK-21）,72h后出现病变,并在BHK-21细胞中盲传3代,通过病毒蚀斑形成试验、间接免疫荧光和荧光定量RT-PCR等方法与亲本株病毒对比分析其感染性的差异。结果表明,突变病毒的蚀斑数和荧光数明显比亲本株少,在感染2-3d后,细胞内病毒RNA的量大约是亲本株的1/2。通过激光共聚焦显微镜观察到,在感染BHK-21细胞的早期（24h）,突变N154病毒与亲本毒的蛋白在细胞内的定位有所不同,突变N154病毒的蛋白在细胞中呈现明显的聚积。突变株病毒脑内接种乳鼠,对乳鼠致病力有所下降。由此可以看出,E蛋白糖基化位点的突变降低了乙脑病毒的复制、影响了蛋白在胞内的折叠以及降低了病毒的致病力,这也将为猪源乙型脑炎病毒弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础。5猪源乙脑病毒prM-E蛋白及其N-糖基化位点突变体的真核质粒构建PrM和E蛋白是乙型脑炎病毒两个重要的囊膜蛋白,将prM、E基因及prM的信号肽序列插入真核表达质粒pVAXI中构建重组真核质粒pVAXI-prME,其中prM和E各含有一个糖基化位点（N15,N154）,单独或联合突变其糖基化位点,将天冬酰胺（N）突变成丙氨酸（A）,构建3株突变的重组真核质粒pVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3,重组质粒转染VERO细胞,利用间接免疫荧光证明亲本与3株突变的重组质粒在真核细胞内能有效的转录和表达；通过肽N-糖苷酶F （PNGase F）作用后,Western-blot检测表明突变糖基化位点的重组真核质粒表达产物的分子量小于亲本质粒的表达产物,并而这些重组质粒都能与JEV单克隆抗体特异性结合,证明其具有一定的生物学活性和抗原性。6猪源乙脑病毒prM、E蛋白N-糖基化位点对Balb/c小鼠的特异性免疫影响为了评价构建的亲本和突变重组真核质粒的免疫效力,将这4株重组真核质粒作为DNA疫苗免疫Balb/c小鼠。将6周龄Balb/c小鼠随机分成5组,每组14只,设pVAXI-prME、pVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3共4个免疫组,同时设pVAXI空载体对照组,肌肉注射免疫,重组质粒的免疫剂量为100μg/只。然后通过测定抗体水平、抗体亚型、中和抗体和细胞因子（IL-4,IL-2和IFN-γ）,并做了攻毒保护试验来衡量突变N154的重组质粒的免疫效果。结果表明：重组质粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3,即突变E基因的N154后,既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫,且体液免疫水平比pVAXI-prME高。抗体亚型分析结果表明,突变N154的重组质粒既能诱导IgG1的分泌又能诱导IgG2a的分泌,但以IgG1为主；同时细胞因子检测结果进一步表明突变N154的重组质粒主要诱导Th2型细胞因子（IL-4）的产生,因此说明其主要诱导产生Th2型免疫应答。攻毒实验结果表明重组质粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3色完全保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染,因此通过突变E基因154位糖基化位点的DNA疫苗可以明显的提高体液免疫应答,并且可以为改良的JEV核酸疫苗提供依据。
叶莺[10]（2011）在《福建省丙型肝炎流行特征及体外细胞培养模型的构建与应用》文中指出目的近年疾病监测网络直报数据显示,我国丙型肝炎报告病例数呈递增态势,而丙型肝炎感染后症状的隐匿性使其易发展成慢性肝炎、肝硬化甚至是肝细胞癌,丙型肝炎已经成为重大的公共卫生问题。我国关于丙型肝炎流行病学、病原学方面的研究较少,而福建省仅在1992年进行过自然人群丙型肝炎抗体阳性率的调查,此后未见大规模的流行病学研究,也未见报道福建省丙型肝炎病毒基因型的分布特征。另外,不同基因型间对抗病毒药物的敏感性不同,而丙型肝炎病毒体外培养模型的缺乏使其在致病机制、疫苗研究、药物筛选等方面的研究长期停滞不前。因此,为了更好地预防和控制丙型肝炎,非常有必要对福建省丙型肝炎的流行特征进行分析,获取丙型肝炎流行现状的基础资料,建立丙型肝炎报告数的预测模型,为丙型肝炎防治策略的制定提供数据支持;此外,建立福建省丙型肝炎流行基因型病毒株的体外培养模型,为丙型肝炎基础研究提供平台,在此基础上进行药物筛查等工作,从实践意义上指导丙型肝炎临床用药。方法1、采用多阶段抽样的方法,通过横断面调查研究,获取丙型肝炎流行现状的基础资料;应用间接ELISA方法检测血清中的丙型肝炎病毒抗体,分析2006年福建省自然人群抗-HCV阳性率;2、通过收集无偿献血者、吸毒者以及医院来源的抗-HCV阳性的血清标本,采用RT-PCR方法,分别进行C/E1区和NS5B区基因的扩增、克隆和测序,应用生物学软件对序列进行分析比较,构建序列的系统发育树,分析福建省不同人群间基因分布的特征;3、根据《中国疾病预防控制信息系统》疫情数据库中福建省2004～2010年HCV的月报发病数据,分析其数据特征,建立最优的发病预测模型;4、应用长片段核酸扩增和基因克隆技术,获取不同亚型HCV基因组的全长序列,构建重组质粒;将福建流行株全长基因与JFH1株的非编码区进行嵌合,经体外转录、Huh7细胞转染,构建不同亚型嵌合的体外细胞培养模型,经IFA、RT-PCR等方法对其进行验证鉴定,并初步将该模型用于体外药物筛选。结果1、福建省自然人群抗-HCV阳性率为0.7%,地区分布无差异,男女无差异,随着年龄增长,抗-HCV阳性率有增加趋势,尤其是50岁以上年龄组,抗-HCV阳性率远高于50岁以下年龄组;虽然1992年人群抗-HCV阳性率的调查存在假阳性率等问题,结合其他资料,可以认为人群抗-HCV阳性率呈下降趋势,但HCV防治形势不容乐观;2、福建省丙型肝炎主要流行基因型为6a和1b,其次为3b和2a,不同人群间流行基因型有差别,临床病例的主要流行基因型为1b,而无偿献血者和吸毒者主要流行基因型为6a,从不同人群间流行基因型分布的差异可以推论,可能存在主要流行基因型由1b向6a转变的情况;还发现可能存在混合感染的情况,主要表现为3b亚型与其他型别的重组;3、《中国疾病预防控制信息系统》疾病监测数据显示,自2004年实行网络直报后,丙型肝炎报告数呈逐年上升趋势,且报告数的上升是由临床诊断病例数上升引起的,实验室确诊病例数基本保持稳定,临床诊断病例数的上升可能有几个方面原因:责任人报告意识增强、感染者发展为病人、报告人掌握的HCV诊断标准不严谨;4、建立的ARIMA（2,1,0）（2,1,0）12（无常数）模型对丙型肝炎月报数进行了较好的跟踪与预测,但由于外界其他因素变化的影响,用于中短期预测效果优于长期预测。5、扩增并拼接了6株不同亚型的丙型肝炎病毒全长基因（其中1b亚型两株,3a、3b、6a及6n亚型各一株）以及1a亚型半长片段;构建了全长重组质粒pBS1、pBR2、pBSR5、pXX4、pXX19及pXQ124;6、成功构建了pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合体外细胞培养模型。pBS1/JFH1经体外转录产生的感染性RNA转染Huh7细胞后产生的衍生病毒可以引起新的Huh7细胞的感染,与pJFH1相比,构建的嵌合株感染力相对较弱;7、将构建的pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合体外细胞培养模型初步应用于药物筛选。研究结果表明INFα能有效抑制病毒复制,而且这种抑制呈剂量依赖性,RBV、NTZ和CsA单独应用也都能抑制HCV病毒的复制,但需要较大剂量,而这三种药物与INFα联合应用,都能显着提高INFα的抗病毒作用。结论1、福建省自然人群抗-HCV阳性率呈现下降趋势,但由于受HCV易慢性化特点的影响,使多年前HCV较高的阳性率表现为目前发病率的逐年增加。2、完成福建省不同人群HCV基因流行型分析,发现可能存在主要流行基因型由1b向6a转变的情况以及目前存在较多HCV混合感染的情况。3、扩增并拼接了6株5个亚型的HCV全长基因,成功构建出pBS1/JFH1（6a/2a）嵌合体外细胞培养模型。该模型用于药物筛选具有可行性,可为深入研究HCV的毒力基因、致病机制等基础性研究提供有利的工具。
二、丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2～3部分基因cDNA克隆序列分析及表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2～3部分基因cDNA克隆序列分析及表达（论文提纲范文）
（1）猪瘟病毒非结构蛋白3的结构解析与功能研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪瘟病毒概述 |
| 1.2 病毒的形态 |
| 1.3 病毒基因组的结构与功能 |
| 1.3.1 非翻译区 |
| 1.3.2 结构蛋白 |
| 1.3.3 非结构蛋白 |
| 1.4 NS3的结构与功能 |
| 1.4.1 NS3蛋白酶的功能 |
| 1.4.2 NS3 NTPase/helicase的功能 |
| 1.4.3 NS3蛋白酶结构域和解旋酶结构域的相互作用 |
| 1.4.4 黄病毒科NS3的结构 |
| 1.4.5 NS3的解旋机制 |
| 1.4.6 NS3与蛋白或核酸的相互作用 |
| 1.5 猪瘟病毒基因组的复制与调控 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、毒株及细胞 |
| 2.1.2 质粒及引物 |
| 2.1.3 常用的酶 |
| 2.1.4 常用仪器、试剂及耗材 |
| 2.1.5 常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的片段的扩增与回收 |
| 2.2.2 酶切与连接 |
| 2.2.3 位点特异性突变 |
| 2.2.4 感受态细胞的制备与质粒转化 |
| 2.2.5 阳性菌落的筛选及鉴定 |
| 2.2.6 蛋白质的诱导表达及鉴定 |
| 2.2.7 蛋白质大量表达及纯化 |
| 2.2.8 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.9 蛋白质结晶及条件优化 |
| 2.2.10 X-ray衍射数据的收集及处理 |
| 2.2.11 结构解析、优化及分析 |
| 2.2.12 RNA的体外转录及纯化 |
| 2.2.13 解旋酶底物的制备 |
| 2.2.14 Helicase活性测定 |
| 2.2.15 ATPase活性测定 |
| 2.2.16 细胞的复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.2.17 质粒DNA及RNA的转染 |
| 2.2.18 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.19 间接免疫荧光检测 |
| 2.2.20 病毒滴度测定 |
| 2.2.21 免疫蚀斑 |
| 第三章 全长NS3蛋白的表达纯化、结晶和结构解析 |
| 3.1 表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.2 重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.1 小量诱导表达及鉴定 |
| 3.2.2 NS3的大量表达及纯化 |
| 3.3 蛋白质结晶及条件优化 |
| 3.4 X-ray衍射数据的收集及结构解析 |
| 3.5 NS3的结构分析 |
| 3.5.1 NS4A~(PCS)-3_(S163A)的结构 |
| 3.5.2 NS3蛋白酶及其辅因子的结构特征 |
| 3.5.3 瘟病毒与HCV中NS3-4A顺式切割的结构证据 |
| 3.5.4 NS3蛋白酶结构域的特征及底物特异性 |
| 3.5.5 NS3分子内相互作用界面的特征 |
| 3.6 蛋白酶辅助解旋酶工作的模型 |
| 3.7 讨论 |
| 第四章 NS3分子内的相互作用与功能 |
| 4.1 突变体的构建及鉴定 |
| 4.1.1 表达突变体的构建 |
| 4.1.2 病毒突变体的构建 |
| 4.2 蛋白突变体的表达及纯化 |
| 4.3 界面突变对ATPase活性的影响 |
| 4.3.1 磷酸根标准曲线的绘制及反应条件的确定 |
| 4.3.2 NS3 ATPase活性的测定 |
| 4.4 界面突变对helicase活性的影响 |
| 4.4.1 解旋底物的制备 |
| 4.4.2 解旋条件的优化 |
| 4.4.3 解旋酶活性的测定 |
| 4.5 界面突变对病毒复制及蚀斑形成的影响 |
| 4.5.1 突变体病毒的拯救 |
| 4.5.2 病毒滴度 |
| 4.5.3 蚀斑形成 |
| 4.6 讨论 |
| 第五章 NS3蛋白酶结构域表面碱性区的功能 |
| 5.1 突变体的构建及鉴定 |
| 5.1.1 表达突变体的构建 |
| 5.1.2 病毒突变体的构建 |
| 5.2 蛋白质的表达及纯化 |
| 5.3 蛋白酶表面碱性氨基酸突变对ATPase活性的影响 |
| 5.4 蛋白酶表面碱性氨基酸突变对helicase活性的影响 |
| 5.5 蛋白酶表面氨基酸突变对病毒拯救和复制的影响 |
| 5.5.1 突变体病毒的拯救 |
| 5.5.2 病毒滴度 |
| 5.6 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（2）猪瘟病毒非结构蛋白p7及其对感染性病毒产生的调节（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 猪瘟病毒分子生物学 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 猪瘟病毒及其基因组结构与功能 |
| 1.2.1 病毒的分类和病毒粒子 |
| 1.2.2 猪瘟病毒基因组结构 |
| 1.2.3 猪瘟病毒的生命周期 |
| 1.2.4 猪瘟病毒编码蛋白的结构与功能 |
| 1.2.5 猪瘟病毒基因组非编码区 |
| 1.3 p7蛋白 |
| 1.3.1 丙型肝炎病毒p7蛋白的结构及功能 |
| 1.3.2 瘟病毒p7蛋白的结构与功能 |
| 1.4 猪瘟病毒的生物学特性 |
| 1.4.1 猪瘟病毒的增殖 |
| 1.4.2 猪瘟病毒感染与免疫逃逸 |
| 1.4.3 CSFV毒力的分子基础 |
| 1.5 本论文研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 菌种和克隆载体 |
| 2.1.3 工具酶、常规试剂、抗体 |
| 2.1.4 常用溶液的配制 |
| 2.1.5 实验仪器及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的DNA的PCR扩增 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.3 DNA目的片段回收 |
| 2.2.4 目的片段与载体的酶切与连接 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 质粒或酶连接产物的转化 |
| 2.2.7 阳性菌落的鉴定与质粒的提取 |
| 2.2.8 细胞复苏、传代和冻存 |
| 2.2.9 质粒或RNA转染细胞: |
| 2.2.10 间接免疫荧光(indirect immunofluorescence staining,IF)实验和共聚焦(Confocal)实验 |
| 2.2.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹实验(Western blot) |
| 2.2.12 免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation assays,Co-IP) |
| 2.2.13 病毒基因组体外转录 |
| 2.2.14 病毒扩增 |
| 2.2.15 基因组RNA提取 |
| 2.2.16 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.2.17 病毒滴度测定 |
| 2.2.18 实时定量PCR (Quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR) |
| 第三章 猪瘟病毒编码蛋白E2、p7和NS2的相互作用 |
| 3.1 猪瘟病毒E2、p7、NS2真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 非结构蛋白p7与NS2和E2的相互作用 |
| 3.3 介导p7和NS2相互作用的NS2区域 |
| 3.4 介导p7和NS2相互作用的p7区域 |
| 3.5 E2p7前体蛋白和NS2的相互作用 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 非结构蛋白p7在调节CSFV基因组复制和感染性病毒产生中的作用 |
| 4.1 基于反向遗传操作构建CSFV突变体cDNA克隆 |
| 4.1.1 感染性克隆pSM/Ap7~(15-51)、pSM/E2/IRES和pSM/E2~(ASG/NSR)的构建 |
| 4.1.2 基于CSFV单顺反子感染性cDNA克隆的p7突变体构建 |
| 4.1.3 基于CSFV双顺反子感染性cDNA克隆的p7突变体构建 |
| 4.2 重组病毒拯救 |
| 4.3 p7蛋白位点突变对p7和NS2相互作用的影响 |
| 4.4 p7氨基酸突变对病毒基因组复制的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的成果 |
| 致谢 |
（3）猪瘟病毒新型反向遗传操作技术平台的建立和病毒复制调控研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第—章 猪瘟病毒分子生物学 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 猪瘟病毒及其基因组结构与功能 |
| 1.2.1 分类 |
| 1.2.2 基因组结构 |
| 1.2.3 猪瘟病毒的生命周期 |
| 1.2.4 猪瘟病毒编码的蛋白 |
| 1.3 瘟病毒NS2蛋白的功能 |
| 1.3.1 NS2蛋白的亚细胞定位 |
| 1.3.2 NS2-3前体蛋白的切割及对病毒特性的影响 |
| 1.3.3 NS2与感染性病毒产生 |
| 1.4 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2的结构与功能 |
| 1.4.1 HCV NS2 N端跨膜区 |
| 1.4.2 HCV NS2~(pro)的晶体结构 |
| 1.4.3 HCV NS2与病毒RNA复制 |
| 1.4.4 HCV NS2与病毒的组装和释放 |
| 1.5 猪瘟病毒生物学特性 |
| 1.5.1 致细胞病变效应 |
| 1.5.2 病毒感染与先天免疫 |
| 1.5.3 病毒毒力 |
| 1.6 猪瘟病毒反向遗传操作技术研究 |
| 1.7 本论文研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、细胞和病毒 |
| 2.1.2 实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 常规试剂、工具酶、试剂盒、抗体和培养基 |
| 2.1.4 常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR扩增目的片段 |
| 2.2.2 DNA目的片段的回收 |
| 2.2.3 目的片段与载体的酶切、连接 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.5 阳性菌落的鉴定及质粒提取 |
| 2.2.6 PK-15细胞基因组DNA提取 |
| 2.2.7 重组质粒的构建 |
| 2.2.8 基因组RNA体外转录 |
| 2.2.9 细胞的复苏、传代及冻存 |
| 2.2.10 cDNA或RNA的转染 |
| 2.2.11 总RNA和病毒RNA提取 |
| 2.2.12 间接免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA) |
| 2.2.13 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.2.14 病毒滴度测定(TCID_(50)/mL) |
| 2.2.15 免疫蚀斑实验 |
| 2.2.16 荧光素酶活性实验 |
| 2.2.17 实时定量RT-PCR(Quantitative real-time RT-PCR qRT-PCR) |
| 2.2.18 蛋白免疫印记(Western blot) |
| 2.2.19 免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP) |
| 2.2.20 cDNA 5'末端的快速扩增(5'-rapid amplification of cDNA end,5 '-RACE)和3'末端的快速扩增(3'-RACE) |
| 第三章 —种高效拯救猪瘟病毒新型反向遗传操作技术的建立 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 基于RNA聚合酶Ⅰ启动子的CSFV石门株cDNA克隆pSPT_I/SM的构建 |
| 3.1.2 基于cDNA克隆pSPT_I/SM的CSFV拯救与鉴定 |
| 3.1.3 vSPT_I/SM的特性 |
| 3.1.4 vSPT_I/SM末端序列分析 |
| 3.1.5 基于RNA聚合酶Ⅰ系统反向遗传操作技术拯救猪瘟疫苗C株病毒 |
| 3.2 讨论 |
| 第四章 非编码区对猪瘟病毒复制的调节作用 |
| 4.1 实验结果 |
| 4.1.1 CSFV强毒石门株非编码区替换猪瘟疫苗C株重组质粒的构建 |
| 4.1.2 非编码区替换的猪瘟疫苗C株重组嵌合病毒的拯救及特性 |
| 4.1.3 猪瘟疫苗C株嵌合突变体病毒在细胞上传代的遗传稳定性 |
| 4.2 讨论 |
| 第五章 非结构蛋白NS2在猪瘟病毒复制中的调控作用及机制 |
| 5.1 实验结果 |
| 5.1.1 CSFV NS2蛋白拓扑结构与N端跨膜区氨基酸序列 |
| 5.1.2 NS2单点突变全长cDNA感染性克隆的构建 |
| 5.1.3 NS2 N端影响感染性病毒产生的关键氨基酸位点 |
| 5.1.4 NS2 N端氨基酸突变对病毒基因组RNA复制的调节 |
| 5.1.5 NS2 N端氨基酸突变对NS2-3前体蛋白加工效率和NS2-NS2相互作用的影响 |
| 5.1.6 NS2 N端氨基酸调控基因组复制不依赖NS2-3的切割 |
| 5.1.7 NS2 N端氨基酸致死突变体的回复及NS2/R100A补偿突变位点NS2/I90L的证实 |
| 5.2 讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表与待发表的文章 |
| 致谢 |
（4）JE疫苗突变株生物学特性及鸭坦布苏病毒流行株基因特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 日本脑炎病毒及其与宿主相互作用概述 |
| 1 日本脑炎的流行特征 |
| 2 日本脑炎的病原特征 |
| 2.1 病毒粒子的性质 |
| 2.2 JEV的基因结构 |
| 2.3 JEV结构蛋白特征 |
| 2.4 JEV非结构蛋白特征 |
| 2.5 JEV毒力基础 |
| 3 JEV的传播特征 |
| 4 JEV的致病机制 |
| 5 JEV疫苗的研究进展 |
| 5.1 鼠脑组织的灭活疫苗 |
| 5.2 细胞培养的弱毒疫苗 |
| 5.3 细胞培养的灭活疫苗 |
| 5.4 基因工程嵌合弱毒活疫苗 |
| 5.5 其他疫苗 |
| 6 宿主针对JEV免疫防御 |
| 6.1 先天性免疫防御 |
| 6.2 适应性免疫防御 |
| 7 日本脑炎病毒对宿主的免疫逃逸 |
| 7.1 JEV抑制干扰素通路 |
| 7.2 JEV抑制NK细胞的免疫监测和细胞毒性作用 |
| 7.3 JEV活化自噬进行免疫逃逸 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第二章 日本脑炎病毒E279对其蚀斑形态和致病力的作用研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 商品化疫苗中JEV的基因含量测定 |
| 2.2 商品化疫苗中JEV的病毒滴度测定 |
| 2.3 四株疫苗病毒的全基因扩增与测序 |
| 2.4 四株疫苗病毒的基因序列比较 |
| 2.5 四株疫苗突变位点的峰图分析 |
| 2.7 四株疫苗株的氨基酸序列分析 |
| 2.8 四株疫苗株5'非编码区RNA二级结构预测结果 |
| 2.9 疫苗株蚀斑纯化后JEV特性分析 |
| 2.10 疫苗株蚀斑纯化后全基因分析 |
| 2.11 JEV E279位显着增加子代病毒的产量 |
| 2.12 JEV E279位显着增加病毒的神经毒力 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 JEV NS1'蛋白在疫苗弱毒株的产生机制及其在病毒感染中的作用研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 全基因的扩增和全长cDNA克隆的构建 |
| 2.2 拯救病毒在体外的生物学特性 |
| 2.3 拯救病毒的全基因分析 |
| 2.4 拯救病毒在BHK-21细胞上的生长曲线特征 |
| 2.5 病毒感染细胞后分泌NS1'蛋白的特征分析 |
| 2.6 NS1'蛋白对JEV神经毒力的影响 |
| 2.7 拯救病毒感染对乳鼠免疫系统的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 体外模拟核糖体移码机制及NS1'蛋白的亚细胞分布特征 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 NS1和NS1'真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2 NS1和NS1'蛋白的表达 |
| 2.3 NS1和NS1'蛋白在BHK-21细胞上的亚细胞分布特征 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 JEV NS1'蛋白对宿主IFN-β信号通路转导的作用研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 IFN-β启动子活性域测试质粒的构建 |
| 2.2 IFN-β启动子报告基因荧光素酶活性的检测 |
| 2.3 NS1'蛋白可以IFN-β启动子的影响 |
| 2.4 NS1'蛋白对IRF7刺激后IFN-β启动子的影响 |
| 2.5 NS1'蛋白抑制Poly(I:C)刺激后NF-κB入核的影响 |
| 2.6 拯救病毒在A549细胞上的生长动力学分析 |
| 2.7 JEV感染早期分析NS1'蛋白对宿主细胞IFN-βmRNA的影响 |
| 2.8 免疫共沉淀和质谱分析鉴定NS1'潜在的互作蛋白 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 鸭坦布苏病毒流行株的全基因特征研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 临床调查和病理变化 |
| 2.2 病原的鉴定与分离 |
| 2.3 全基因和氨基酸序列分析 |
| 2.4 DTMUV-AH2011分离株遗传进化关系 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
（5）猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞和中和抗体的功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫学研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒基因组结构和亚基因组mRNA |
| 1.2 病毒非结构蛋白 |
| 1.3 病毒结构蛋白 |
| 1.3.1 病毒粒子及N蛋白 |
| 1.3.2 主要外膜蛋白 |
| 1.3.3 次要外膜蛋白 |
| 1.4 病毒生物学特性 |
| 2 免疫学 |
| 2.1 宿主抗病毒感染免疫应答 |
| 2.2 机体对PRRSV的先天性免疫应答 |
| 2.2.1 PRRSV对干扰素诱导的干扰作用 |
| 2.2.2 PRRSV编码蛋白对IFN诱导和激活信号的抑制 |
| 2.2.3 毒株和细胞对干扰素诱导的影响 |
| 2.3 获得性免疫应答 |
| 2.3.1 体液免疫反应 |
| 2.3.2 细胞介导的免疫应答 |
| 2.4 调节性T细胞与PRRSV |
| 2.4.1 Tregs的背景 |
| 2.4.2 病毒介导的Tregs活性 |
| 2.4.3 猪Tregs的表型和分布 |
| 2.4.4 猪Tregs抑制机制和目标 |
| 2.4.5 Tregs与PRRSV |
| 3 疫苗 |
| 4 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 我国出现猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3部分基因缺失的新毒株 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 PAMs分离与培养 |
| 1.3 病毒分离 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 RNA提取及RT-PCR扩增 |
| 1.6 PCR产物的纯化与回收。 |
| 1.7 PCR回收产物的克隆与转化 |
| 1.8 重组质粒的提取 |
| 1.9 重组质粒的鉴定和测序 |
| 1.10 核苷酸和aa序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 RT-PCR扩增及全基因组测序 |
| 2.3 全基因组序列比对和分析 |
| 2.4 系统进化分析 |
| 2.5 病毒基因重组分析 |
| 2.6 UTRs基因序列分析 |
| 2.7 GP3推导的氨基酸序列比对分析 |
| 2.8 GP5推导的氨基酸序列比对分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 不同毒力美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs能力的比较 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 猪PBMCs的分离 |
| 1.3 MoDCs细胞的培养 |
| 1.4 HP-PRRSV对PBMCs的感染 |
| 1.5 不同PRRSV毒株对MoDCs的感染 |
| 1.6 抗体标记及流式检测 |
| 1.7 CD4~+CD25~(high)细胞的分选 |
| 1.8 抑制活性测定 |
| 1.9 细胞因子测定 |
| 1.10 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MoDCs的培养 |
| 2.2 PRRSV感染共培养系统对Tregs的诱导作用 |
| 2.3 Tregs的抑制功能检测 |
| 2.4 不同毒力PRRSV毒株对Tregs的诱导 |
| 2.5 细胞因子TGF-β和IL-10的测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 核衣壳蛋白第15N和46Raa残基在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 合成肽 |
| 1.2 表达PRRSV结构蛋白重组杆状病毒的构建 |
| 1.2.1 PRRSV结构蛋白基因片段克隆引物设计和合成 |
| 1.2.2 目的片段扩增及重组pFastBac Dual载体的获得 |
| 1.2.3 重组质粒的酶切和测序鉴定 |
| 1.2.4 重组Bacmid的构建与鉴定 |
| 1.2.5 重组杆状病毒的获得与扩增 |
| 1.2.6 重组结构蛋白杆状病毒的表达与Western Blot鉴定 |
| 1.2.7 重组杆状病毒表达蛋白的纯化 |
| 1.3 PRRSV N蛋白基因点突变毒株全长cDNA克隆的构建 |
| 1.3.1 BB0907全长cDNA克隆质粒pCMV-BB的构建 |
| 1.3.2 BB0907毒株相关点突变毒株cDNA全长克隆的构建 |
| 1.4 重组病毒的拯救 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 |
| 1.6 病毒生长曲线测定 |
| 1.7 猪Tregs细胞诱导试验 |
| 1.8 流式方法检测Tregs细胞 |
| 1.9 细胞因子测定 |
| 1.10 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 HP-PRRSV结构蛋白重组杆状病毒的构建及表达 |
| 2.1.1 目的片段扩增及重组pFastBac Dual载体的构建 |
| 2.1.2 重组Bacmid的鉴定 |
| 2.1.3 重组杆状病毒的获得及目的基因表达 |
| 2.1.4 重组杆状病毒表达蛋白的纯化 |
| 2.2 重组蛋白诱导Tregs细胞的检测 |
| 2.3 不同毒力PRRSV毒株N蛋白诱导Tregs能力比较 |
| 2.4 N蛋白合成肽诱导Tregs细胞的检测 |
| 2.5 合成肽突变体诱导Tregs细胞的检测 |
| 2.6 PRRSVN蛋白基因突变毒株的构建 |
| 2.7 重组PRRSV毒株对Tregs诱导能力比较 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体抗性毒株的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 中和抗体血清 |
| 1.2 中和抗体抗性突变毒株的获得 |
| 1.3 抗性毒株基因测序 |
| 1.4 血清中和试验 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 |
| 1.6 抗体于病毒结合能力分析 |
| 1.7 病毒生长曲线 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 NAb抗性毒株的获得 |
| 2.2 NAb抗性毒株序列分析 |
| 2.3 抗性毒株与抗体结合能力测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白诱导中和抗体的关键氨基酸位点的确定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 中和抗体血清 |
| 1.2 血清中和试验 |
| 1.3 PRRSV感染性cDNA克隆的构建 |
| 1.3.1 BB和BB34s株全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 1.3.2 BB和BB34s毒株相关点突变毒株cDNA全长克隆的构建 |
| 1.4 重组病毒的拯救 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 |
| 1.6 抗体结合分析 |
| 1.7 病毒生长曲线 |
| 1.8 在PAMs进行的病毒单复制周期中和测定试验 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组PRRSV拯救 |
| 2.2 中和抗体结合位点的确定 |
| 2.3 抗性毒株与抗体结合能力分析 |
| 2.4 GP5蛋白Y102C和G104R突变抵抗NAb中和作用能力比较 |
| 2.5 不同NAb血清对抗性突变株的中和滴度测定 |
| 2.6 抗性毒株在PAMs上的中和滴度测定 |
| 2.7 抗性毒株与野生型毒株序列比对 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 高致病性PRRSV对高原藏香猪的致病性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 PAMs感染试验 |
| 1.3 猪体感染试验 |
| 1.4 病理学检查 |
| 1.4.1 病理组织切片制备 |
| 1.4.2 HE染色 |
| 1.5 免疫组化检测PRRSV |
| 1.6 荧光定量PCR检测PRRSV |
| 1.6.1 样品RNA提取 |
| 1.6.2 反转录 |
| 1.6.3 Real-time PCR |
| 1.7 PRRSV TCID_(50)测定 |
| 1.8 M-ELISA方法测定细胞因子 |
| 1.9 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PAMs培养感染试验 |
| 2.2 猪体感染试验 |
| 2.2.1 临床症状观察 |
| 2.2.2 病理学观察 |
| 2.2.3 病毒血症测定结果 |
| 2.2.4 不同脏器组织中PRRSV测定 |
| 2.3 细胞因子水平的测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
（6）犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 犬瘟热概况 |
| 1.1.1 CDV病原学特性 |
| 1.1.2 麻疹病毒属病毒受体分子 |
| 1.1.3 CDV致病机理和CD临床症状 |
| 1.1.4 我国CDV流行现状及其病原生态学概况 |
| 1.2 CD的免疫与防治 |
| 1.3 负链RNA病毒反向遗传学技术 |
| 1.3.1 不分节段负链RNA病毒的复制和转录 |
| 1.3.2 负链RNA病毒反向遗传操作系统研究进展 |
| 1.3.3 负链RNA病毒反向遗传操作技术的建立 |
| 1.3.4 负链RNA病毒反向遗传操作系统及其应用研究 |
| 1.3.5 CDV病毒反向遗传操作系统及其应用研究 |
| 2 犬瘟热病毒TM-CC株全基因组序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒毒株与载体 |
| 2.1.2 全基因组测序及序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 全基因组cDNA序列拼接 |
| 2.2.2 全基因组cDNA序列分析及其同源性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 犬瘟热病毒TM-CC株反向遗传操作系统的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒株、细胞与载体 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 引物设计 |
| 3.1.4 RT-PCR扩增各基因片段及各片段阳性质粒的克隆 |
| 3.1.5 辅助质粒构建 |
| 3.1.6 CDV-TM-CC全长基因组的构建 |
| 3.1.7 病毒拯救 |
| 3.1.8 间接免疫荧光对救获病毒的检测 |
| 3.1.9 Western blotting |
| 3.1.10 rCDV-TM-CC种毒的制备及滴定 |
| 3.1.11 病毒生长动力学曲线的测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CDV-TM-CC野毒株基因组全长cDNA克隆和辅助质粒的构建 |
| 3.2.2 病毒拯救 |
| 3.2.3 间接免疫荧光检测拯救的病毒 |
| 3.2.4 Western blotting |
| 3.2.5 救获病毒体外生长特性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 表达绿色荧光蛋白重组犬瘟热病毒TM-CC株病毒系统的构建及其生物学特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒株、细胞与载体 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 引物设计与合成 |
| 4.1.4 表达EGFP外源基因片段的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 4.1.5 病毒的拯救 |
| 4.1.6 救获病毒的序列鉴定 |
| 4.1.7 重组病毒rCDV-TM-CC-EGFP在VerodogSLAM细胞上生长特性 |
| 4.1.8 救获病毒免疫荧光检测 |
| 4.1.9 Western blotting |
| 4.1.10 种毒的制备及滴定 |
| 4.1.11 病毒生长动力学曲线的测定 |
| 4.1.12 重组病毒遗传稳定性的检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 含有EGFP基因重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 4.2.2 病毒的拯救 |
| 4.2.3 重组病毒rCDV-TM-CC-EGFP在VerodogSLAM上感染特性 |
| 4.2.4 激光共聚焦检测拯救的病毒 |
| 4.2.5 Western blotting |
| 4.2.6 重组病毒体外生长特性 |
| 4.2.7 重组病毒遗传稳定性的检测 |
| 4.2.8 重组病毒H基因抗原表位差异性及表面静态可及性分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 表达CPV VP2蛋白的重组CDV/R-20/8株的构建及其生物学特性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 病毒株与载体 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 |
| 5.1.3 引物设计与合成 |
| 5.1.4 CPV基因组DNA的提取 |
| 5.1.5 表达CPV VP2蛋白重组CDV/R-20/8基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 5.1.6 表达CPV VP2蛋白的重组病毒CDV/R-20/8-VP2的拯救 |
| 5.1.7 间接免疫荧光检测拯救的病毒 |
| 5.1.8 Western blotting |
| 5.1.9 种毒的制备及滴定 |
| 5.1.10 病毒生长动力学曲线的测定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 表达CPV VP2蛋白重组CDV/R-20/8基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 5.2.2 表达CPV VP2蛋白重组CDV/R-20/8病毒的拯救 |
| 5.2.3 间接免疫荧光对重组病毒rCDV/R-20/8-VP2进行检测 |
| 5.2.4 Western blotting |
| 5.2.5 重组病毒rCDV/R-20/8-VP2体外生长特性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 PED 的流行 |
| 1.1.1 国外流行情况 |
| 1.1.2 国内流行情况 |
| 1.2 PEDV 的分类地位 |
| 1.3 PEDV 的分子特征 |
| 1.3.1 5’非编码区和 3’非编码区（5’UTR, 3’UTR） |
| 1.3.2 复制酶基因及其产物 |
| 1.3.3 结构基因及其产物 |
| 1.4 PED 的诊断 |
| 1.5 PED 的治疗 |
| 1.6 PED 的疫苗研究 |
| 1.7 冠状病毒反向遗传学的研究 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PEDV 全基因组序列分析及 2011 年流行毒株 S 基因分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞和毒株 |
| 2.1.2 样品 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 病毒 RNA 提取 |
| 2.1.7 cDNA 合成 |
| 2.1.8 PCR |
| 2.1.9 PCR 产物鉴定及纯化回收 |
| 2.1.10 PCR 产物连接与转化 |
| 2.1.11 重组质粒提取、鉴定及序列测定 |
| 2.1.12 全基因组及 S 基因序列确定、分析和比较 |
| 2.1.13 参考序列 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 CV777-P125、CH/S、CH/FJND-3/2011 基因组结构 |
| 2.2.2 CV777-P125、CH/S、CH/FJND-3/20115’UTR、3’UTR 的分子特征 |
| 2.2.3 CV777-P125、CH/S、CH/FJND-3/2011 复制酶基因 |
| 2.2.4 CV777-P125、CH/S、CH/FJND-3/2011 转录调节序列（TRSs）的特征 |
| 2.2.5 PEDV S 基因的分子特征 |
| 2.2.6 PEDV 流行毒株系统发育关系 |
| 2.2.7 PEDV S 基因同源性分析 |
| 2.2.8 PEDV S 蛋白分子特征 |
| 2.2.9 PEDV S 蛋白糖基化位点分析 |
| 2.2.10 PEDV S 蛋白抗原区域、抗原表位分析 |
| 2.2.11 PEDV S 蛋白同源性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 CV777-P125、CH/S、CH/FJND-3/2011 全基因组序列 |
| 2.3.2 2011 年流行毒株分析 |
| 第三章 PEDV 感染性克隆的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞、载体、感受态细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 限制性内切酶的选择 |
| 3.1.5 pBAC-PEDV-5’-3’中间质粒构成元件及引物 |
| 3.1.6 pBAC-PEDV-5’-3’中间质粒的构建 |
| 3.1.7 pBAC-PEDV-5’-3’中间质粒的鉴定 |
| 3.1.8 pBAC-PEDV-5’-3’中间质粒（逆 LacZ 方向）重新构建 |
| 3.1.9 目的片段扩增引物 |
| 3.1.10 目的片段扩增、回收 |
| 3.1.11 目的片段酶切、回收 |
| 3.1.12 中间质粒 pBAC-PEDV-5’-3’线性化处理 |
| 3.1.13 重组质粒鉴定引物 |
| 3.1.14 目的片段连接、重组质粒鉴定 |
| 3.1.15 全长 cDNA 连接、鉴定 |
| 3.1.16 重组病毒的拯救 |
| 3.1.17 重组病毒的鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CMV-PEDV 5’片段的扩增 |
| 3.2.2 PEDV3’-HDV-BGH 片段的扩增 |
| 3.2.3 CMV-PEDV5’-3’-HDV-BGH 片段的扩增、酶切 |
| 3.2.4 pBAC-PEDV-5’-3’中间质粒的鉴定 |
| 3.2.5 pBAC-PEDV-5’-3’中间质粒（逆 LacZ 方向）重新构建 |
| 3.2.6 目的片段的扩增、酶切 |
| 3.2.7 目的片段、中间质粒 pBAC-PEDV-5’-3’酶切产物回收、纯化 |
| 3.2.8 pAB、pC、pDE 、pDEAB 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.9 pBAC-PEDV-Full 质粒鉴定 |
| 3.2.10 pBAC-PEDV-Full 质粒序列分析 |
| 3.2.11 重组病毒的鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 0.1 HCV的分子生物学特征 |
| 0.2 丙型肝炎病毒感染周期与病毒RNA的复制 |
| 0.3 HCV复制子系统 |
| 0.4 HCV全长细胞培养系统 |
| 0.5 支持HCV复制子及HCV全长基因组复制的细胞系 |
| 0.6 1b型HCV全基因细胞培养系统的研究现状 |
| 0.7 本研究的目的和意义 |
| 0.8 总结与展望 |
| 第一章 HCV 5’端半基因组的扩增及其序列对PEG-IFN/RBV治疗1 b亚型CHC疗效的影响 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 HCV 1b replicon细胞培养系统的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 我国丙型肝炎流行株1b型全基因HCV细胞培养系统的建立 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕/博士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）日本脑炎病毒NJ2008株人工突变致弱及其N-糖基化位点的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写及名称 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 日本脑炎病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1 JEV的分子生物学特性 |
| 1.1 JEV的基因组特性 |
| 1.2 JEV的结构蛋白和非结构蛋白特性 |
| 1.3 JEV的基因分型 |
| 2 JEV扩散的机制 |
| 3 JEV的毒力及致病机理 |
| 4 JEV疫苗的研究概况 |
| 4.1 传统的鼠源灭活疫苗 |
| 4.2 减毒活疫苗 |
| 4.3 DNA疫苗 |
| 4.4 嵌合病毒减毒活疫苗 |
| 4.5 单位疫苗 |
| 4.6 全长基因组cDNA减毒活疫苗 |
| 参考文献 |
| 第二章 动物RNA病毒反向遗传技术的研究进展 |
| 1 动物RNA病毒反向遗传系统的构建策略 |
| 1.1 全长cDNA的构建 |
| 1.2 感染性转录物的产生 |
| 2 不同类型的动物RNA病毒反向遗传技术的操作策略 |
| 2.1 正链RNA病毒反向遗传技术 |
| 2.2 负链RNA病毒的反向遗传技术 |
| 3 反向遗传操作的应用 |
| 3.1 用于病毒基因结构、功能以及致病力的研究 |
| 3.2 用于疫苗的研制 |
| 参考文献 |
| 第三章 病毒囊膜蛋白N-糖基化的生物学功能 |
| 1 病毒蛋白质的糖链 |
| 2 N-糖基化修饰病毒 |
| 3 糖基化在病毒胞膜蛋白转运折叠和分泌中的作用 |
| 4 糖基化对病毒毒力的影响 |
| 5 糖基化对病毒蛋白免疫原性的影响 |
| 6 糖基化与病毒感染 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第四章 猪源乙型脑炎病毒NJ2008株全基因克隆及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、质粒、菌株及细胞 |
| 1.2 主要试剂、工具酶 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 NJ2008株RNA的提取、RT-PCR及克隆 |
| 1.6 序列分析 |
| 1.7 病毒细胞TCID_(50)测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 JEV NJ2008株各片段RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 新分离乙脑NJ2008病毒株的基因特性分析 |
| 2.3 JEV NJ2008株在BHK-21细胞上生长滴度的测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 猪源乙型脑炎病毒NJ2008株感染性克隆的构建及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 JEV NJ2008株全长cDNA克隆的构建 |
| 1.3 病毒的拯救 |
| 1.4 JEV NJ2008株感染性克隆的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 JEV NJ2008株各片段RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 JEV NJ2008株SUP和HYPO片段PCR扩增结果及酶切 |
| 2.3 JEV NJ2008株全长cDNA的鉴定 |
| 2.4 JEV NJ2008株感染性克隆的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 猪源乙脑病毒E138位突变株感染性克隆的构建与病毒拯救 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 E138突变株全长cDNA克隆的构建 |
| 1.3 病毒的拯救 |
| 1.4 E138突变感染性克隆病毒株的鉴定及生物学特性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 片段SUP1和重组质粒pSK-HYPO的酶切 |
| 2.2 E138突变感染性克隆病毒株的连接 |
| 2.3 E138突变感染性克隆病毒株的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 猪源乙脑病毒NJ2008株N-糖基化位点的突变影响病毒的复制、胞内定位以及致病力 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 N154突变株全长cDNA克隆的构建 |
| 1.3 病毒的拯救 |
| 1.4 N154突变株感染性克隆的鉴定及生物学特性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 片段SUP2和重组质粒pSK-HYPO的酶切 |
| 2.2 N154突变感染性克隆病毒株的连接 |
| 2.3 N154突变感染性克隆病毒株的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 猪源乙脑病毒prM-E蛋白及其N-糖基化位点突变体的真核质粒构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 重组真核表达载体pVAXI-prME的构建 |
| 1.3 N-糖基化位点突变重组表达质粒的构建 |
| 1.4 质粒的大量提取 |
| 1.5 重组真核质粒的体外表达与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组亲本及突变表达质粒的构建 |
| 2.2 Western-blot分析结果 |
| 2.3 IFA鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 猪源乙脑病毒prM、E蛋白N-糖基化位点对Balb/c小鼠的特异性免疫影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 JEV病毒抗体和抗体亚型检测 |
| 2.2 脾T细胞亚群分析 |
| 2.3 血清中IL-4和IFN-γ的测定 |
| 2.4 JEV中和抗体的产生及对致死量JEV的保护力 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）福建省丙型肝炎流行特征及体外细胞培养模型的构建与应用（论文提纲范文）
| 主要英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 福建省丙型肝炎的流行特征 |
| 第一章 自然人群丙型肝炎血清流行病学调查 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 福建省不同人群间 HCV 基因型分布特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 2004~2010 年丙型肝炎发病率趋势分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 体外细胞培养模型的构建及初步应用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2～3部分基因cDNA克隆序列分析及表达（论文参考文献）
- [1]猪瘟病毒非结构蛋白3的结构解析与功能研究[D]. 郑峰伟. 武汉大学, 2017(02)
- [2]猪瘟病毒非结构蛋白p7及其对感染性病毒产生的调节[D]. 赵程. 武汉大学, 2017(01)
- [3]猪瘟病毒新型反向遗传操作技术平台的建立和病毒复制调控研究[D]. 李玲. 武汉大学, 2015(01)
- [4]JE疫苗突变株生物学特性及鸭坦布苏病毒流行株基因特征研究[D]. 王经满. 南京农业大学, 2015(06)
- [5]猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞和中和抗体的功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析[D]. 范宝超. 南京农业大学, 2015(06)
- [6]犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建[D]. 李维克. 东北林业大学, 2014(01)
- [7]猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建[D]. 陈建飞. 中国农业科学院, 2012(10)
- [8]1b型丙型肝炎病毒半基因序列分析及体外细胞培养系统的建立[D]. 曾艳丽. 南方医科大学, 2012(04)
- [9]日本脑炎病毒NJ2008株人工突变致弱及其N-糖基化位点的功能研究[D]. 张羽. 南京农业大学, 2011(06)
- [10]福建省丙型肝炎流行特征及体外细胞培养模型的构建与应用[D]. 叶莺. 福建医科大学, 2011(09)