一、Inhibition of epidermal growth factor receptor expression by RNA interference in A549 cells（论文文献综述）
周志辉[1]（2021）在《2-芳基-4-芳甲胺基嘧啶类第四代EGFR抑制剂的设计、合成与抗肿瘤活性研究》文中提出肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症,而非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌死亡率的80%。研究表明,EGFR信号通路与肿瘤的侵袭、转移等密切相关。因此,抑制EGFR相关信号通路可以显着抑制肿瘤细胞的生长和扩散。近些年来,以EGFR为靶点的小分子抑制剂在临床治疗过程中取得了显着的成果,但不可避免的出现耐药性问题,导致其对NSCLC患者的疗效降低。因此,迫切需要开发能够有效抑制EGFRT790M/C797S突变的新型第四代EGFR抑制剂。本论文基于计算机辅助药物设计,总结了文献报道的Angew2017-7634-1构效关系,通过结构拼合、生物电子等排原理等手段,设计合成了3系列62个2-芳基-4-芳甲胺基嘧啶类EGFR抑制剂。主要改造如下:（1）根据生物电子等排等原理,保留先导化合物Angew2017-7634-1的活性结构,并在2-芳基引入不同位点取代的氢键供/受体;在4-氨基部分引入不同杂环结构以及增加杂环与4-氨基的碳链长度,探究影响化合物与蛋白氨基酸SER797形成氢键相互作用的因素。设计合成了第一系列2-芳基-4-氨基喹唑啉类衍生物ZZH-1～ZZH-38,共38个目标化合物。（2）为了改善第一系列目标化合物溶解性较差问题,在前期研究的基础上,将小分子仲胺结构引入到4-芳甲胺基部分,期望增强化合物的溶解度,进而增加化合物的抑制活性。设计合成了第二系列嘧啶甲胺取代喹唑啉类衍生物ZZH-39～ZZH-46,共8个目标化合物。（3）基于第一和第二系列的抗肿瘤活性结果以及课题组前期研究,运用结构拼合等原理,将噻喃并嘧啶骨架代替喹唑啉结构,并且保留小分子仲胺结构。设计合成了第三系列2-芳基-4-氨基噻喃并嘧啶类衍生物ZZH-47～ZZH-62,共16个目标化合物。以Angew2017-7634-1为先导化合物,A549、H460、MCF-7、H1975和Ba/F3细胞为测试细胞株,采用MTT法对设计合成的62个目标化合物进行体外抗肿瘤活性测试。结果表明,与先导化合物Angew2017-7634-1相比,大部分目标化合物对所测试的细胞都展现出中等至强的抗肿瘤活性。其中,化合物ZZH-24、ZZH-41和ZZH-61作为各个系列最有前途的衍生物,不仅对所测试细胞表现出优异的抗肿瘤活性,而且在10μM浓度下能有效抑制EGFRDel19/T790M/C797S三重突变型Ba/F3细胞,抑制率分别是91.0%、71.43%和99.8%。根据抗肿瘤活性测试结果,筛选出抗肿瘤活性较优的化合物进行EGFRWT、EGFRL858R/T790M和EGFRDel19/T790M/C797S激酶活性测试。结果显示,大部分所测化合物对EGFRWT和EGFRL858R/T790M激酶抑制效果都大于10μM。化合物ZZH-24、ZZH-41和ZZH-61对EGFRL858R/T790M展现出中等至强抑制活性,IC50值分别是0.74、8.88和0.33μM。此外,最有期望的化合物ZZH-24和ZZH-61对EGFRDel19/T790M/C797S表现出有效的抑制活性,IC50值分别为475.5和133.5 n M,并且化合物ZZH-61在10μM浓度下对EGFRDel19/T790M/C797S激酶抑制率达到98.2%。进一步对优选化合物ZZH-24、ZZH-41和ZZH-61进行活性研究,如AO细胞染色实验、Axinnex V-FITC细胞凋亡实验、荧光定量PCR实验以及流式细胞周期实验等。结果显示,化合物ZZH-24、ZZH-41和ZZH-61不仅以剂量依赖的方式诱导A549细胞的晚期凋亡,而且以剂量依赖的方式阻断A549细胞周期停滞在S期。分子对接研究表明化合物ZZH-24、ZZH-41和ZZH-61可以与EGFR蛋白紧密结合,并且与EGFRT790M/C797S蛋白形成4个氢键,引入的小分子仲胺结构伸入溶剂区,有助于增强化合物的亲和性。基于化合物体外抗肿瘤活性研究及分子对接结果,化合物的构效关系归纳如下:（1）2-芳基邻位羟基能够与EGFRT790M/C797S蛋白中氨基酸残基MET793和GLN791形成氢键相互作用,是维持化合物生物活性的关键基团;（2）4-氨基侧链部分中杂环上杂原子（N/O）和NH能够与SER797形成2个氢键,这对EGFRDel19/T790M/C797S突变细胞维持活性至关重要;（3）氟原子的引入不利于化合物的抗肿瘤活性;（4）噻喃并嘧啶结构的引入有利于增强化合物体外抗肿瘤活性以及激酶活性,但是其氧化物丧失对EGFRL858R/T790M激酶的抑制活性;（5）小分子仲胺结构的引入能够增加化合物溶解度,进而增加化合物的活性。综上所述,本论文以Angew2017-7634-1为先导化合物,对其进行结构修饰改造,设计得到了3个系列62个2-芳基-4-芳甲胺基嘧啶类EGFR抑制剂,并对其构效关系及作用机制进行了初步分析及探讨,为今后该类抑制剂的深入研究奠定了基础。
李小丰[2]（2021）在《PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究》文中研究说明背景:目前,肺恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大敌人之一,中国癌症发病和死亡统计显示,2015年我国肺癌的新发病例数为78.7万,死亡人数为63.1万,均列癌症首位。根据临床和病理特点的不同,肺癌分为小细胞肺癌（占13%）和非小细胞肺癌（占87%）,其5年总生存率仅为18.2%。传统的治疗方法包括手术、化疗、放疗等,但对于晚期肺癌患者均疗效不佳。近年来,随着分子靶向治疗的兴起,非小细胞肺癌的无进展生存期和总生存期都得到了显着改善。具有敏感基因突变的肺癌患者,分子靶向治疗是最有效的治疗方式之一,而对于没有敏感突变或在靶向治疗过程中发生靶基因耐药突变的患者而言,发现新的肿瘤生物学标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。鱼精蛋白-1（PRM1）是肿瘤-睾丸抗原（CTA）的一种,CTA在正常情况下只在睾丸组织中表达,而其它组织不表达或极低表达,但当机体出现肿瘤时则可以在某些肿瘤组织中高表达,肿瘤-睾丸抗原也因此得名。既往对于PRM1的研究主要集中在男性生殖领域。近年来,随着CTA在肿瘤领域研究的深入,关于PRM1在恶性肿瘤中的作用也逐渐被重视,研究发现PRM1是结肠癌相关的肿瘤-睾丸抗原基因,利用RT-PCR技术分析PRM1在结肠癌和癌旁组织的表达水平,发现肠癌组织中PRM1-m RNA水平明显高于癌旁和正常组织。也有研究发现PRM1在慢性淋巴细胞白血病患者中高表达,PRM1也被认为是慢性淋巴性白血病的CTA基因。另有研究表明,PRM1在恶性肿瘤中的异常表达,可能与肿瘤的生长侵袭相关。在动物实验中,给裸鼠皮下注射PRM1蛋白可明显提高小鼠肠道肿瘤的发生率。目前为止,尚无关于PRM1在非小细胞肺癌中表达情况的报道,课题组的前期工作已证实,与正常组织比较,PRM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高。同时,PRM1对非小细胞肺癌细胞具有促进增殖作用。本研究中,我们检测了PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达情况,分析了PRM1蛋白水平与临床特征的相关性;并评估了PRM1在非小细胞肺癌中的诊断价值;通过过表达和敲低PRM1基因观察其对细胞增殖、凋亡及周期的影响;建立非小细胞肺癌裸鼠转移瘤模型,检测转移瘤裸鼠外周血PRM1蛋白的表达水平,观察外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。旨在评估PRM1作为新的生物学标志物对非小细胞肺癌的诊断价值,研究PRM1对非小细胞肺癌细胞的促增殖作用,并对其机制作初步探讨。方法:1、收集110例非小细胞肺癌肿瘤组织、配对正常组织、术前血清和健康者血清标本,应用RT-PCR法、免疫组织化学染色法和ELISA法检测其中PRM1基因和蛋白水平,应用卡方检验统计分析患者肿瘤组织和外周血中PRM1蛋白水平与临床特点的相关性。2、评估PRM1的诊断价值,应用SPSS软件统计分析外周血中PRM1蛋白水平对非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌的诊断价值,并与临床常用的肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1进行比较,评估PRM1诊断价值的优劣性。3、观察细胞内PRM1表达水平对细胞增殖的影响,通过质粒构建技术及si RNA转染技术,过表达和敲低A549、NCI-H460细胞的PRM1基因,应用RTPCR和ELISA法检测细胞PRM1基因和蛋白表达水平,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。4、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对细胞增殖的影响,将人源重组PRM1蛋白和PRM1抗体加入到A549、NCI-H460细胞培养液中,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况。5、观察细胞在不同营养状态下PRM1的表达情况,将A549、NCI-H460细胞培养于含不同浓度血清的培养液中,应用RT-PCR法和ELISA法检测细胞的PRM1基因及蛋白水平。6、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对动物转移瘤生长的影响,制备裸鼠转移瘤模型,将非小细胞肺癌细胞A549皮下注射到裸鼠背部偏右侧,肿瘤形成后,（1）应用ELISA法检测转移瘤裸鼠和健康裸鼠外周血PRM1蛋白水平,并分析其差异性;（2）分别经尾静脉注射人源重组PRM1蛋白、PRM1抗体及两者混合剂,每3日测量并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。（3）第33天于麻醉下处死裸鼠,取出肿瘤组织,测量重量并计算肿瘤体积,分析外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。结果:1、非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1的m RNA和蛋白水平较配对正常组织明显升高。统计分析显示:随着肿瘤组织中PRM1蛋白水平的增加,肿瘤T分期越晚,淋巴结转移阳性率越高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润无相关性;2、非小细胞肺癌患者外周血中PRM1蛋白水平较健康者显着升高。统计分析显示,淋巴结转移阳性和临床分期较晚的患者外周血中的PRM1蛋白水平更高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润不相关。3、PPM1对于非小细胞具有较高的诊断价值。SPSS软件统计分析显示:（1）外周血中PRM1蛋白水平在非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌中均具有较高的诊断价值。（2）在肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在肺鳞癌中,PRM1的诊断价值明显强于SCC且与CYFRA21-1相当;（3）含有PRM1的肿瘤标志物组合的诊断价值明显高于传统组合;（4）在早期的肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在早期肺鳞癌中,PRM1诊断价值高于SCC且不劣于CYFRA21-1。提示PRM1具有较高的非小细胞肺癌诊断价值。4、非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的PRM1 m RNA水平较人正常肺上皮细胞株BEAS-2B明显升高;同样,A549、NCI-H460细胞内和培养液中的PRM1蛋白水平较BEAS-2B细胞均显着升高。5、成功构建PRM1过表达和敲低的A549、NCI-H460细胞株模型,与对照组比较,过表达PRM1促进A549和NCI-H460细胞的增殖,而敲低PRM1则抑制细胞的增殖。6、外源性PRM1重组蛋白能够促进非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖,而PRM1抗体则抑制细胞增殖。7、不同营养状态下PRM1的表达存在差异。实验结果显示,随着细胞培养液中血清浓度的降低,A549和NCI-H460细胞PRM1表达水平显着增加。8、细胞周期检测结果提示,过表达PRM1使细胞周期中G0/G1期比例降低,S期细胞比例增加,肿瘤细胞增殖活跃;而敲低PRM1则使细胞周期发生G0-G1期阻滞,S期细胞比例降低,肿瘤细胞增殖受抑;细胞凋亡结果显示,敲低PRM1对A549和NCI-H460细胞的凋亡水平无显着影响。9、动物实验结果:（1）与健康对照组比较,转移瘤裸鼠外周血中PRM1蛋白水平明显升高,也证实了动物实验和体外细胞实验结果与人体组织实验结果一致。（2）外源性PRM1重组蛋白具有促进裸鼠转移瘤生长的作用,而PRM1抗体则抑制转移瘤生长。实验结果提示,与对照组比较,经尾静脉给予外源性PRM1重组蛋白的裸鼠肿瘤生长速度快,肿瘤体积大,而给予PRM1抗体的裸鼠肿瘤生长速度较慢,且肿瘤体积较小。结论:1、PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的特异性高表达,及其对非小细胞肺癌特别是早期患者的诊断价值,使其具备了成为非小细胞肺癌血清学肿瘤标志物的潜质。2、过表达和敲低PRM1基因双向验证了其对非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的促增殖作用,这种作用与增加细胞周期中S期细胞比例相关,而非抑制细胞的凋亡。3、细胞内外PRM1蛋白水平的增加均可促进细胞的增殖,提示PRM1促增殖作用可能存在多条途径,为进一步研究PRM1的作用机制提供线索。4、营养供应差时细胞PRM1的表达水平反而增加,这种负反馈调节作用在一定程度上解释非小细胞肺癌在血供不良的情况下仍快速生长的原因。5、外源性PRM1重组蛋白和抗体对裸鼠转移瘤生长的影响,进一步在生物体内验证了PRM1促进肿瘤生长的作用,同时,PRM1抗体的抑瘤作用也为其成为肿瘤治疗靶点提供直接的理论支持。
刘天宇[3]（2021）在《FGF13调节A549细胞ROS生成及凋亡的机制研究》文中研究表明成纤维细胞生长因子13（Fibroblast growth factor13,FGF13）属于成纤维细胞生长因子家族成员,在哺乳动物大脑、骨骼肌和卵巢中均有表达。最新研究发现,FGF13在宫颈癌、乳腺癌和胰腺癌等癌组织中高表达,并促进癌症的增殖、侵袭和转移。此外,FGF13被发现在肺癌中也高表达,促进肺癌细胞的增殖及存活,但与非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞凋亡的关系及机制尚不清楚。本研究建立稳定干扰FGF13的A549细胞株,通过转录组测序分析干扰FGF13后差异基因表达情况,并进行GO和KEGG富集分析,探讨FGF13在A549细胞中可能参与调控的差异基因和相关的信号通路,进而探究FGF13对A549细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）生成的影响与机制,在细胞和蛋白水平初步探究FGF13对A549细胞凋亡的影响及分子机制,为解析FGF13在NSCLC中的生物学功能提供参考。本研究主要获得实验结果如下:1.成功建立了两组稳定干扰FGF13的A549细胞株,其中FGF13-sh RNA-1组细胞株在m RNA和蛋白水平干扰效率分别为90%和62%,可用于后续研究。2.转录组测序分析结果发现,干扰FGF13引起A549细胞内大部分差异基因上调,并影响多种细胞组件的基因表达。其中,差异基因主要富集在细胞增殖、迁移、凋亡、代谢和氧化还原等多种过程。3.FGF13可能通过调控NADPH氧化酶4（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4）蛋白表达和核因子E2相关因子2（Nuclear factor-erythroid2-related factor 2,Nrf2）介导的抗氧化体系调节A549细胞ROS的生成。4.干扰FGF13促进A549细胞凋亡,且抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）表达下调,而促凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3）及Cleaved caspase-3表达上调,结合FGF13调控ROS生成的研究结果,提示FGF13可能通过ROS/Caspase-3通路调控A549细胞凋亡。结论:FGF13可能调控NOX4蛋白表达以及Nrf2介导的抗氧化体系从而调节细胞内ROS的生成,并可能通过ROS/Caspase-3通路调控A549细胞凋亡。
陈凯[4]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中指出一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
夏敏[5]（2021）在《糖基转移酶GALNT2调控肺腺癌放射抵抗的机制研究》文中研究说明背景:肺癌是我国和世界上发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤。肺腺癌是肺癌最常见的组织学亚型,平均5年生存率约为15%。肺腺癌起病隐匿,多数患者就诊时已为局部晚期或出现远处转移,往往失去根治性手术机会。因此,临床上对于不能手术的早期、不可切除的局部晚期肺腺癌患者,放射治疗是控制病灶的主要手段。但是,放射治疗的最大障碍在于肿瘤细胞存在放射抵抗,这也是导致肺腺癌患者放疗失败和死亡的重要因素。糖基转移酶GALNT2是催化O-聚糖合成的起始酶,其异常表达在多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,调控肿瘤细胞增殖、粘附、侵袭、转移等恶性表型。但是,GALNT2与肺腺癌放射抵抗的关系尚不清楚。目的:本课题旨在研究GALNT2在肺腺癌放射抵抗中的作用,并探讨GALNT2调控肺腺癌放射抵抗的分子机制。方法:（1）采用Oncomine和TCGA数据库分析肺腺癌组织中GALNT2 m RNA表达水平,采用免疫组织化学技术检测肺腺癌标本中GALNT2蛋白表达水平,并进行生存分析。（2）通过i TRAQ定量蛋白质谱分析肺腺癌亲本细胞和放射抵抗细胞中GALNT2的表达差异,并通过Western blot技术验证。（3）在肺腺癌亲本细胞中转染GALNT2过表达慢病毒,在放射抵抗细胞中转染GALNT2 RNA干扰慢病毒,通过克隆形成实验和流式细胞术,分析GALNT2表达改变对肺腺癌细胞放射抵抗的影响。（4）采用质谱、凝集素pull-down等技术筛选GALNT2的靶向修饰糖蛋白,并通过功能回复实验进行验证。（5）将GALNT2下调表达细胞注射入裸鼠皮下,构建肺腺癌荷瘤裸鼠模型。监测肿瘤大小及生长情况,绘制肿瘤生长曲线,放射线处理后比较其放射敏感性差异。结果:（1）Oncomine、TCGA分析显示,与正常组织相比,GALNT2 m RNA在肺腺癌组织中显着高表达。免疫组化结果显示,肺腺癌组织中GALNT2蛋白表达明显高于癌旁组织。生存分析显示,GALNT2高表达患者总生存期缩短,预后差。（2）采用定量蛋白质组学技术筛选,并通过Western blot验证,同时检索CAZy、GGDB、KEGG glycan等数据库分析发现,GALNT2是唯一的一种在肺腺癌放射抵抗细胞中表达增加的糖基转移酶。（3）在肺腺癌放射抵抗细胞中,当GALNT2的表达被下调后,细胞的克隆形成能力下降,凋亡比例和G2/M期细胞增加,放射抗性降低。在肺腺癌亲本细胞中,当GALNT2的表达被上调后,细胞的克隆形成能力上升,凋亡比例和G2/M期细胞减少,放射抗性升高。（4）采用特异性识别O-聚糖的凝集素VVA进行pull-down,同时联合质谱技术鉴定发现,IGF-1R存在O-糖基化修饰。过表达GALNT2,可增加IGF-1R的O-糖基化水平。抑制GALNT2,可使IGF-1R的O-糖基化水平降低。同时,沉默IGF-1R可逆转GALNT2介导的肺腺癌细胞放射抵抗。（5）抑制GALNT2表达,可使裸鼠瘤体生长减慢,体积缩小,重量减轻,放射敏感性增加。结论:（1）GALNT2在肺腺癌组织中高表达,且与患者的不良预后密切相关。（2）体内、外实验均证实GALNT2对肺腺癌放射抵抗具有调控作用。（3）GALNT2通过促进IGF-1R O-糖基化从而介导肺腺癌放射抵抗。总之,本课题从细胞、动物、组织三个层次揭示GALNT2调控肺腺癌放射抵抗的新机制,可为克服肺腺癌放射抵抗提供新靶点,并为肺腺癌放射敏感性预测和个体化放疗提供科学依据,具有重要的理论意义和临床转化价值。
毛勇[6]（2021）在《circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌进展的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景肺癌是一种很常见的恶性肿瘤,其每年的发病率和病死率位居世界各大肿瘤的第一位。肺癌种类多样,治疗难度大,预后差。因此,寻找更有效的治疗靶点和诊断标志物具有临床迫切性,同时对于肺癌发生发展中具体机制的研究将有利于其诊治。近年来,环状RNA（circular RNA,circRNA）成为生物医学研究的热点,其具有物种保守性、稳定性和表达特异性,在肿瘤等疾病发生过程中发挥重要的调控作用,有望成为临床诊断治疗的新靶点和标志物。目前,对于circRNA在肺癌中的研究已有一定进展,但还需要更多和更深入的研究探讨,期望为肺癌的诊治提供更可靠的理论支持。因此,本研究针对肺癌中低表达的circFOXP1展开具体的体内外实验,探讨其作用的具体分子机制。研究方法第一部分:circFOXP1在肺癌细胞中的作用。1.荧光定量PCR检测circFOXP1在各种肺癌细胞系中的表达水平。2.构建circFOXP1过表达载体转染肺癌细胞,荧光定量PCR检测其过表达水平。3.CCK-8法检测circFOXP1对肺癌细胞增殖活性的影响。4.流式检测circFOXP1对肺癌细胞凋亡水平的影响。5.Transwell法检测circFOXP1对肺癌细胞侵袭能力的影响。第二部分:circFOXP1竞争性吸附miR-558而促进下游靶基因TNFAIP1和TPM1的表达。1.核质分离检测circFOXP1的细胞表达定位。2.筛选与circFOXP1结合的miRNAs。3.双荧光素酶报告基因实验检测circFOXP1与miR-558的结合。4.RNA-pull down检测circFOXP1与miR-558在胞内是否直接结合。5.免疫共沉淀检测circFOXP1、miR-558与AGO2蛋白结合能力。6.荧光定量PCR检测miR-558在各种肺癌细胞系中的表达水平。7.miR-558靶基因筛选。8.双荧光素酶报告基因实验检测miR-558与靶基因TNFAIP1、TPM1的结合。9.荧光定量 PCR 检测 circFOXP1、miR-558 对靶基因 TNFAIP1、TPM1 的表达影响。10.Western blot 检测 circFOXP1、miR-558 对靶基因 TNFAIP1、TPM1 的表达影响。第三部分:circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌进展。1.circFOXP1过表达载体、miR-558模拟物或抑制物、TNFAIP1或TPM1的过表达载体或siRNA分别转染或共转染肺癌细胞。2.CCK-8法检测肺癌细胞增殖活性水平。3.流式检测肺癌细胞凋亡水平。4.Transwell法检测肺癌细胞侵袭能力。5.筛选稳定高表达circFOXP1或miR-558的A549细胞。6.构建裸鼠成瘤模型。7.记录瘤组织生长曲线和体积。8.荧光定量 PCR 检测 circFOXP1、miR-558、TNFAIP1、TPM1 的表达。9.Western blot检测TNFAIP1、TPM1的蛋白表达水平。研究结果第一部分:1.circFOXP1在肺癌细胞系中表达下调。2.circFOXP1抑制肺癌细胞的增殖活性。3.circFOXP1促进肺癌细胞的凋亡发生。4.circFOXP1抑制肺癌细胞的侵袭能力。第二部分:1.circFOXP1主要表达于细胞质中。2.circFOXP1抑制miR-558在肺癌细胞中的表达。3.circFOXP1在肺癌细胞中与miR-558直接结合。4.miR-558高表达于肺癌细胞系中。5.TNFAIP1和TPM1均是miR-558的靶基因。6.miR-558能阻断circFOXP1促TNFAIP1和TPM1表达的作用。第三部分:1.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌细胞增殖活性。2.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路促进肺癌细胞凋亡发生。3.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路降低肺癌细胞侵袭水平。4.circFOXP1抑制肺癌裸鼠瘤的生长和大小。5.miR-558阻断circFOXP1抑裸鼠瘤生长的作用。6.circFOXP1通过miR-558促进TNFAIP1和TPM1在裸鼠瘤中的表达。研究结论1.circFOXP1在肺癌细胞中表达下调,而miR-558表达上调。2.circFOXP1通过竞争性结合miR-558而抑制miR-558表达,进而促进下游靶基因TNFAIP1和TPM1的表达。3.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌细胞增殖和侵袭,同时促进凋亡。4.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌裸鼠瘤的生长。
刘武胜[7]（2021）在《羟基红花黄色素A对非小细胞肺癌增殖和迁移的作用及其机制》文中进行了进一步梳理研究背景:我国的癌症患者病死率较高,中国在全球的癌症死亡率中占比达54%左右。其中肺癌是最常见且恶性程度极高的一种疾病。肺癌在65岁以后发病率迅速增加,且发病率随着年龄的增加逐渐增加。根据患者肺癌组织细胞在镜下的形态特点,预后和治疗意义,世界卫生组织（WHO）将肺癌初步分为小细胞肺癌（Small-cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer,NSCLC）这两种类型。其中非小细胞肺癌又可以进一步分为大细胞癌、腺癌和鳞状细胞癌。近些年来随着我们对疾病生物学和肿瘤进展机制的了解,非小细胞肺癌的治疗在临床实践临床前实验中已经取得了重要的进展。在NSCLC肺癌的早期,手术切除治疗是临床医生常采用的方法之一。但NSCLC即使在实施手术完全切除后,许多患者仍有肺癌复发和发生远处转移的风险,且有不少切除肿瘤的NSCLC患者,死于复发性NSCLC,这表明这些患者在手术切除时就有到一定比例的微小转移灶。由于肺癌早期缺乏特异性的诊断的症状患者不易察觉,并且肿瘤生长快速,早期检测发现NSCLC具有极大的挑战,大多数肺癌患者在诊断时已经为晚期疾病。为了提高NSCLC的生存率,许多研究证明了化疗对NSCLC的益处,化疗方案虽对非小细胞肺癌具有一定疗效,但毒副作用反应大。目前临床上对于中晚期NSCLC的治疗主要以分子靶向、免疫治疗以及化疗药物为主,虽然新药不断被研发上市,但是中晚期NSCLC的整体治愈率仍然低下。因此,寻找新的治疗方案是治疗非小细胞肺癌的一个全新的策略。中草药已广泛应用于中晚期非小细胞肺癌的医治,但其疗效和安全性仍存在争议。最近,人们把研究重点放在数百年来一直在临床应用的传统药物上。临床中有不少用于治疗癌症的药物来自于天然产物或者改良后的天然产物。然而,目前对天然药物尤其是中药这个巨大的宝藏还没有充分的利用起来,中药的治疗还仅仅停留在治疗,具体的机制尚需要进一步探索。从各种药用植物、水果和蔬菜中提取的一些新的化学单体具有巨大的抗癌潜力。此外,这些从植物中获得的单体或者中药有效成分调控多种分子信号通路,包括炎症、凋亡和抗凋亡蛋白、和蛋白激酶活性的调控。因此,现代医学的研究方法和手段是值得传统医学吸收和借鉴的。同样,传统医学中的使用药物是经过实践检验的,从传统药物中发现药物的作用可以大大减少药物的研发周期,减低研发成本,从而降低病患的医疗费用。两者可以相互学习,取长补短。这样对于疾病的治疗以及中医药的现代化也有益处。红花黄色素类成分为醌式查尔酮类化合物,是多种水溶性成分的混合物。存在于菊科植物红花（Carthamus tinctorius）的干燥花瓣中。它已经作为药材在民间广泛的使用。红花黄色素类化合物最具代表性的是具有羟基官能团水溶性较好的羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A,HSYA）.从发现HSYA以后,人们对它的科学应用价值越来越感兴趣,越来越多地研究发现了它的健康功效。既往研究发现,HSYA能显着性抑制促进血管新生的标志物的表达如CD105、VEGF-A蛋白。从而能够使肿瘤的新生血管生成作用减弱而发挥抗肿瘤作用。然而,它在肺癌中的作用以及机制目前研究较少。因此,基于以上研究,本实验继续拟以人非小细胞肺癌H1299和A549为研究对象,初步探讨HSYA对肺癌细胞株增殖和迁移的作用和可能机制,为丰富临床非小细胞肺癌的化疗治疗提供一定的参考。第一部分:HSYA对非小细胞肺癌细胞增殖的影响目的:探究HSYA对人非小细胞肺癌细胞系A549及H1299增殖活性的作用,并通过计算IC50值来衡量药物对细胞的毒性。方法:1、细胞培养:A549及H1299细胞分别加入含1%双抗（青霉素和链霉素）和10%胎牛血清的DMEM完全培养基,然后将其置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养至细胞融合到瓶底80%左右传代一次。2、CCK-8法检测不同浓度下HSYA对A549及H1299细胞增殖的影响:将对数生长期细胞消化后重悬制成单细胞悬液,然后接种于96孔培养板,细胞密度为6×103个/孔,实验分为两组,其中向实验组的细胞加入不同浓度梯度的HSYA（0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、100μM）,在培养箱中共孵育48h,另外一组加入不含药物的DMEM培养基作为对照组,加入CCK-8试剂,避光条件下测定各孔的OD值,计算各浓度组的细胞增殖抑制率和半数抑制浓度IC50。3、CCK-8法检测HSYA对A549及H1299细胞处理不同时间下细胞增殖的影响:0.25%胰酶消化处于对数生长期细胞后,用完全培养基重悬细胞,制成单细胞悬液,接种于96孔培养板,细胞的密度为6×103个,待细胞贴壁后去培养液并加入特定浓度的HSYA分别与A549及H1299细胞共孵育,每组设5个复孔,分别培养24h、48h、72h,同时设置对照组。根据测得的吸光度（OD）值,计算不同时间作用下HSYA对细胞的生长抑制作用。4、免疫荧光法检测HSYA处理A549及H1299后对细胞增殖标志性蛋白Ki67表达的影响:将细胞爬片用镊子小心放入六孔板中,将细胞接种到六孔板,待细胞贴壁后实验分为两组,一个给20μM HSYA处理48h,另一组加入PBS作为对照,之后将培养基弃掉,加入多聚甲醛固定15min后封闭,孵育Ki67一抗,之后加入相对应的二抗。正置荧光显微镜拍照。结果:1、CCK-8结果显示:HSYA在不同浓度下（10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、100μM）均能抑制A549及H1299细胞的增殖,并且这种抑制作用随着浓度的增加抑制作用显着增强,HSYA对A549的IC50值:25.44±3.89μM HSYA对H1299的IC50值:15.14±1.17μM。2、CCK8结果显示:HSYA在20μM时候随着作用时间的延长对A549及H1299的抑制作用也随之增加（24h,48h,72h）。HSYA（20μM）作用于A549的细胞24h后的细胞增殖抑制率为:19.42±1.23%作用48h后,增殖率抑制率为:52.47±3.32%,不同时间作用下HSYA组间差异有统计学意义（P<0.05）,作用72h后,增殖抑制率为:59.61±2.23%。为了方便后续的实验,我们选取与IC50值较为接近的即20μM HSYA作用48h。同样,HSYA作用于H1299细胞结果与上述一致。3、免疫荧光结果显示:与对照组相比,HSYA（20μM）处理过的A549及H1299中荧光的强度显着下降,具有统计学意义。结论:不同浓度的HSYA对A549和H1299细胞的体外增殖均有抑制作用,在一定范围浓度内HSYA对两株细胞的增殖抑制率具有浓度依赖性。随着HSYA作用时间的延长,对非小细胞肺癌株的增殖抑制率也随之增加。第二部分:HSYA通过调控EGF诱导的FAK,AKT通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖目的:探讨HSYA通过调控EGF诱导的FAK,AKT通路抑制肺癌细胞的增殖。方法:1、HSYA对A549及H1299细胞FAK,AKT蛋白的表达和活化水平的测定:用30μM HSYA处理细胞0、2、4、6、8、10h后,在冰上提取细胞蛋白,检测A549及H1299这两株细胞在不同时间的HSYA处理下FAK,AKT蛋白的表达差异。2、检测HSYA对EGF诱导FAK,AKT磷酸化水平的影响:实验分为四组,第一组为30μM HSYA单独处理A549和H1299细胞,24h后提取蛋白;第二组为EGF单独作用组,第三组为EGF和HSYA同时处理细胞组,第四组为对照组。所有组在处理细胞24h后提取蛋白并检测FAK,AKT的表达。FAK抑制剂PF-562271对A549及H1299细胞中FAK,AKT磷酸化水平的分组同上。3.CCK-8检测HSYA通过调控EGF诱导的FAK,AKT通路抑制肺癌细胞的增殖:分别用HSYA或10μM PF-562271预处理A549及H1299细胞60min,然后再用1ng/ml的EGF和预处理过的细胞共孵育48h后,CCK8检测细胞的增殖。结果:1.Western Blot检测结果显示,与对照组相比,A549细胞在HSYA处理8h和10h后,p-FAK和p-Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;其中p-Akt在HSYA处理后的4h后即显着下降,10h后下降更明显。而p-FAK在HSYA处理后的8h才发生显着变化。同样,H1299在HSYA处理6h后,p-FAK和p-Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.05）而且,随着处理时间的延长,p-FAK和p-Akt蛋白表达水平的降低趋势更加显着。2.在A549细胞株中,与对照组相比,EGF能够明显增加p-FAK和p-Akt的表达。HSYA可以逆转EGF导致的p-FAK和p-Akt的表达水平的改变。同样,FAK抑制剂PF-562271也可以逆转EGF导致的p-FAK和p-Akt的表达水平的改变。在H1299细胞株中,Western blot结果与A549细胞中的结果一致。3.EGF可以促进非小细胞肺癌A549和H1299细胞增殖。使用HSYA与EGF同时处理这两株细胞则可抑制细胞的增殖,与此同时FAK特异性抑制剂和EGF同时处理也可抑制细胞的增殖。结论:HSYA抑制EGF引起的A549和H1299细胞的增殖能力,这种抑制作用与调控FAK,AKT信号通路的相关。第三部分:HSYA对非小细胞肺癌细胞迁移的影响目的:探讨HSYA对非小细胞肺癌细胞株迁移的影响以及可能的相关分子机制。方法:1、不同浓度的HSYA对肺癌细胞迁移的影响:取对数生长期细胞,分别用浓度为0,20和30μM的HSYA处理A549和H1299细胞,分别在24h,48h置于倒置显微镜拍照观察。2.荧光定量PCR实验检测不同浓度的HSYA作用A549和H1299细胞,48h后,对两种细胞内VEGF,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达水平的影响。以了解HSYA对肺癌细胞转移的机制。结果:1、与对照组相比,H1299在20μM和30μM的HSYA处理24h和48h后细胞迁移的能力较弱,差异有统计学意义（P﹤0.05）。A549细胞在20μM的HSYA处理细胞48h后,细胞的迁移能力显着减弱,而在20μM的HSYA处理细胞24h后,细胞的迁移变化不明显,无统计学差异。两株细胞在30μM处理细胞后显着抑制细胞迁移的能力结果一致。2、不同浓度HSYA（20μmol/L、30μmol/L）作用于A549和H1299细胞,培养24h和48h后,与对照组相比,20μM和30μM的HSYA处理后的细胞中的VEGF,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达水平显着下降。HSYA组较空白对照组相比差异有统计学意义（P﹤0.05）。结论:HSYA作用于A549和H1299细胞,可以抑制细胞的迁移,也可以通过下调肿瘤迁移相关的MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA的表达,这可能是HSYA抑制肿瘤细胞迁移的部分分子机制。
付义林[8]（2021）在《利用超分辨成像研究非小细胞肺癌细胞膜Trop2蛋白分布及其调控机制》文中提出全球范围内,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）已成为癌症患者致死的首要原因。在酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）被引入治疗之前,大多数接受铂类联合化疗的晚期NSCLC患者的总生存期不到一年。上世纪70年代,患者的基线表现、疾病程度、体重减轻等是生存的主要预测指标,随着不断对导致肿瘤异常生长和存活的分子深入研究,现已极大的改变了NSCLC的治疗前景,进入了基于肿瘤分子特征的治疗时代,也使得个性化分子靶向治疗和临床应用成为可能。非小细胞肺癌是一个多阶段、多步骤的复杂发展过程,可能会持续数年到数十年,并且在这个过程中从基因到特异性的蛋白质常共同参与,随着异常表达的逐步积累,最终导致了肿瘤的发生。此外,单细胞层面的蛋白质正常或异常表达也会影响细胞的生长和存活,而后,每个从体细胞到癌细胞的转变都对癌症的发生发展产生影响。细胞膜是细胞生命的重要组成部分,是发生众多生化反应的场所,而细胞膜蛋白作为其中的重要组成部分,参与了大量的生理过程。因此,解析细胞膜表面蛋白在肺癌中的差异表达将为理解肿瘤的分子调控机制提供线索,进一步实现其在实体肿瘤治疗中的诊断和治疗潜力。近几十年对于细胞信号通路的研究在不断深入,虽然已经确定了很多重要信号通路中的蛋白质分子,但提高亚细胞层面上的生物过程认知,将有助于更加详细的描述细胞膜上发生的复杂生理变化和相互作用,帮助我们更加完整的理解肺癌机制。膜蛋白Trop2最初作为侵袭性滋养细胞的标志物被发现,随后发现其在多种肿瘤中发挥驱动作用,可以赋予癌细胞增殖、侵袭等能力,并参与癌症复发、转移。因此研究Trop2在NSCLC中表达情况及作用机制,将有助于拓宽NSCLC的潜在治疗靶点。由于膜蛋白的分子尺寸一般为数十纳米,远小于普通光学显微镜的衍射极限,无法对其进行直接解析。但是,近年来以直接随机光学重构显微镜（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,dSTORM）为代表的超分辨荧光显微技术突破了光学衍射极限,在便捷的前提下实现了纳米级尺度的超分辨成像,因此,我们利用超分辨成像研究NSCLC细胞膜表面Trop2蛋白的差异性分布及其相关调控机制,将为阐明肺癌中特异蛋白质的作用机制做出重要贡献。在实验准备阶段,首先确定dSTORM采集图像的原始帧数、超分辨率数据的重构、定位点密度计算方式等基础条件,随后采用Nano J-SQUIRREL及SR-Tesseler对超分辨重构图像进行评估及数据量化。实验一,首先利用dSTORM探究Trop2蛋白在3种主要NSCLC细胞系中的表面分布模式,并与对照组的HBE细胞系作比较,构建Trop2蛋白的亚细胞结构模型。发现相较于正常HBE细胞,Trop2蛋白在NSCLC细胞膜表面分布了更多的蛋白分子,并且Trop2蛋白的分布模式在不同细胞系之间存在差异,NSCLC细胞膜表面形成了更多、更大、更密集的蛋白簇,同时蛋白簇内的分子数也更密集。实验二,在人类原代肺癌细胞中予以验证。发现原代细胞也同样具有上述规律,提示Trop2蛋白在细胞膜的过度表达及簇状分布模式具有潜在肺癌诊断价值。实验三,应用dSTORM对Trop2在细胞膜上的分布机制进行探究。首先,探究细胞极性,也即细胞的顶-底极性,对Trop2分布特征的影响。Trop2蛋白在A549及HBE细胞的顶膜上均具有更高的表达分子点数,并且更容易形成大面积、多数目的蛋白簇,表明细胞极性会影响膜蛋白的不对称分布。随后,应用超分辨双色成像及脂筏竭耗实验,探究Trop2蛋白与细胞膜表面脂筏结构的关系。脂筏微区与Trop2蛋白在细胞膜表面具有高度的共定位效应,而脂筏结构的竭耗会破坏Trop2蛋白分布模式的稳定性,进一步改变Trop2蛋白的分布并导致成簇能力降低。此外,Trop2蛋白也与非小细胞肺癌细胞表面的肌动蛋白骨架存在联系,当破坏细胞肌动蛋白骨架时表现为Trop2蛋白的成簇受限,如簇数目及面积的减少,但其对Trop2成簇的影响要小于脂筏。最后,为了进一步探究NSCLC中的Trop2蛋白是否存在异常激活,我们选择IGF-1与Trop2相互作用,并探索了其激活状态与蛋白分布之间的联系。发现IGF-1对Trop2蛋白分子的刺激作用主要表现在正常支气管上皮细胞,可以促进其细胞膜表面的Trop2表达量增加及成簇聚集;而癌细胞膜表面仅有Trop2蛋白表达量的增加,因此我们推测Trop2蛋白在癌细胞膜表面成簇分布是激活/活跃状态的表现。实验四,探究Trop2蛋白在细胞膜的成簇分布被破坏后对于下游相关信号蛋白表达及细胞迁移侵袭的影响。发现NSCLC细胞膜表面的Trop2蛋白成簇分布被破坏后,下游信号蛋白包括ERK1/2、p ERK以及细胞周期蛋白Cyclin D1/Cyclin E1均有不同程度的表达减弱,并且相应的癌细胞迁移及侵袭能力均受到限制;而使用IGF-1刺激后上述信号蛋白表达上升,且相应的癌细胞迁移侵袭能力也增强。表明Trop2蛋白分子在肺癌细胞膜表面的成簇分布对下游信号蛋白及细胞表型具有重要影响。综上所述,本研究以NSCLC中的膜蛋白Trop2为研究对象,利用超分辨成像以及细胞生物学技术探究了Trop2蛋白的分布及调控机制,将Trop2蛋白的定位、分布特点和分子组成与它们行使的功能联系起来。帮助我们从纳米级尺度上更全面透彻地了解目标分子在肺癌中的结构特点、定位变化以及相互作用的关系,为进一步揭示复杂的信号转导通路的机制奠定了基础。
费晶[9]（2021）在《SNCG对高糖环境下的肺癌细胞的作用及对ERK活化的影响》文中研究表明目的:本研究旨在探讨SNCG是否能影响高血糖诱导的肺癌细胞增殖。方法:通过高糖诱导的肺癌细胞,在体外模拟肺癌糖尿病患者的病理生理状态。用CCK-8法检测转染和葡萄糖处理后HBE细胞和肺癌细胞的增殖情况。通过反转录-定量（RT-q）PCR分析,分析了单独的HBE细胞和肺癌细胞或高葡萄糖诱导的细胞中SNCG、IGF-1和IGF-1R的m RNA表达水平。此外,RT-q PCR分析用于确定转染效率。采用克隆形成、伤口愈合和ELISA法检测高糖诱导和转染后肺癌细胞的克隆形成能力、迁移和炎症情况。采用western blot分析法测定高糖诱导转染后肺癌细胞中SNCG、IGF-1、IGF-1R、ERK 1/2、磷酸化（p）-ERK1/2和JNK的蛋白表达水平。结果:1.高糖可以明显促进A549细胞、NCI-H1975细胞和SK-MES-1细胞的增殖。用25mM葡萄糖处理后可显着增加A549,NCI-H1975和SK-MES-1细胞在24和48h的增殖,差异有统计学意义（P<0.001）。2.高糖诱导后的肺癌细胞的SNCG、IGF-1和IGF-1R的表达水平增加。高糖（25mM）处理肺癌细胞后,肺癌细胞中SNCG、IGF-1和IGF-1R的表达与HBE细胞相比增加;SNCG、IGF-1和IGF-1R在A549细胞中的表达最高。因此,选择A549细胞进行后续实验。3.抑制SNCG可抑制高糖诱导的肺癌细胞的增殖、克隆形成能力转染siRNA-SNCG-#1的A549细胞中SNCG的表达最低;因此,选择siRNA-SNCG-#1进行后续实验。高糖（25mM）处理A549细胞后,A549细胞增殖增强,不受siRNA-NC转染的显着影响。抑制SNCG抑制A549细胞的增殖;在AXL1717处理后观察到同样的效果。克隆形成试验结果表明,各组A549细胞克隆形成能力的趋势与A549细胞增殖的趋势一致。4.抑制SNCG抑制高糖诱导的肺癌细胞迁移。高糖（25mM）处理增强了A549细胞的迁移,而高糖（25mM）诱导的A549细胞转染siRNANC时,A549细胞的迁移没有明显变化。抑制SNCG抑制高糖（25mM）诱导的A549细胞的迁移;在AXL1717处理后观察到同样的效果。5.抑制SNCG可减轻高糖诱导的肺癌细胞炎症。高糖（25mM）诱导的A549细胞TNF-α水平显着升高,siRNA NC转染不影响这些细胞TNF-α水平。抑制SNCG和AXL1717处理可降低高糖（25mM）诱导的A549细胞TNF-α水平。高糖（25mM）上调转染siRNANC的A549细胞和A549细胞IL-6水平。抑制SNCG可逆转高糖（25mM）对IL-6水平的促进作用,与AXL1717治疗相似。6.抑制SNCG可抑制SNCG、IGF-1、IGF-1R、ERK1/2和p-ERK1/2的表达,同时促进高糖诱导的A549细胞中JNK的表达。高糖（25mM）促进SNCG,IGF-1和IGF-1R的表达,siRNA NC转染后未见明显改变。高糖（25mM）诱导的A549细胞中SNCG、IGF-1和IGF-1R的表达在siRNASNCG转染或AXL1717处理后下降。与AXL1717处理相比,siRNA-SNCG转染对SNCG表达的抑制作用更显着;与siRNA-SNCG转染相比,AXL1717处理对IGF-1R表达的抑制作用更显着。高糖（25mM）上调ERK1/2和p-ERK1/2水平,而高糖（25mM）诱导的A549细胞中JNK表达下调)。抑制SNCG抑制ERK1/2和p-ERK1/2水平,同时促进高糖（25mM）诱导的A549细胞JNK表达)。AXL1717处理对ERK1/2、p-ERK1/2和JNK表达的影响与SNCG抑制作用一致。结论:抑制SNCG可抑制高糖诱导的肺癌细胞增殖。
戴璐[10]（2021）在《细胞黏附分子2（CADM2）与非小细胞肺癌脑转移的相关性研究》文中指出第一部分:细胞黏附分子2调控非小细胞肺癌脑转移的研究背景:非小细胞肺癌脑转移患者预后差、生活质量低下,研究非小细胞肺癌脑转移的机制从而为治疗患者提供依据成为重要课题。方法:采用人类全转录本芯片检测伴有转移非小细胞肺癌与不伴有转移非小细胞肺癌组织标本差异基因。qRT-PCR进一步扩大样本量验证差异基因的表达。siRNA及oeRNA将目的基因转染至细胞建模及转染效果观察。划痕及Transwell实验分别检测A549、H322细胞转染siRNA及oeRNA后的迁移和侵袭能力的改变。Western blot检测分别检测A549、H322细胞转染siRNA及oeRNA后的EMT相关蛋白表达。检测小鼠接种CADM2高表达A549细胞后的脑转移情况。Transwell实验检测干扰MYC表达后对CADM2高表达细胞侵袭能力的影响。结果:芯片筛选出675个上调基因和569个下调基因。qRT-PCR验证显示CADM2在脑转移非小细胞肺癌组织中高表达,与芯片结果一致。通过转染siCADM2沉默了 A549、H322 细胞 CADM2 表达,转染 oeCADM2 升高了 A549、H322细胞CADM2表达。CADM2表达降低时,细胞迁移和侵袭能力下降,且Vimentin蛋白的表达量明显下降,而E-cadherin蛋白的表达量增加;CADM2表达升高时,细胞迁移和侵袭能力上升,且Vimentin蛋白的表达量明显增加,而E-cadherin蛋白的表达量下降。小鼠接种CADM2高表达A549细胞后脑转移率高。CADM2高表达细胞在干扰MYC表达后侵袭能力下降。结论:1.CADM2在非小细胞肺癌脑转移中高表达。2.CADM2可促进非小细胞肺癌细胞系迁移与侵袭。3.CADM2可促进非小细胞肺癌脑转移。4.CADM2可能通过MYC调控非小细胞肺癌脑转移。第二部分细胞黏附分子2与非小细胞肺癌脑转移患者预后及临床因素的相关性分析目的:分析CADM2与NSCLC脑转移患者预后及临床因素的关系。方法:收集广州医科大学附属肿瘤医院2015年1月至2017年12月的NSCLC脑转移患者的病例资料及临床样本。qRT-PCR检测临床样本的CADM2基因表达。随访患者总生存。统计学分析CADM2基因表达水平与患者总生存及临床因素之间的相关性。结果:纳入139例非小细胞肺癌脑转移患者。x2检验分析基因表达水平高低与性别、年龄、肿瘤位置、组织学、肿瘤T分期、有无脑外转移、是否吸烟均无明显相关,差异无统计学意义（P>0.05）;与淋巴结转移N分期存在相关,CADM2基因表达越高,淋巴结N分期越大,差异有统计学意义（P<0.05）。经Log-Rank检验CADM2高表达组与低表达组两组的生存时间有统计学差异（P<0.05）,CADM2高表达与不良预后相关。单因素COX回归分析结果显示,影响生存时间预后因素包括年龄（P=0.031）和CADM2表达水平（P=0.026）,而性别、肿瘤位置、组织学、肿瘤T分期、淋巴结N分期、有无脑外转移、是否吸烟均与患生存时间均无关。将年龄和CADM2表达水平多因素COX回归分析,结果显示CADM2表达水平是影响非小细胞肺癌脑转移患者生存的独立危险因素（P<0.05）。结论:1.CADM2表达与非小细胞肺癌脑转移患者淋巴结N分期相关,CADM2表达高提示着淋巴结转移可能性大。2.CADM2高表达与非小细胞肺癌脑转移患者不良预后存在相关,并且CADM2表达水平是影响非小细胞肺癌脑转移患者生存的独立危险因素。
二、Inhibition of epidermal growth factor receptor expression by RNA interference in A549 cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Inhibition of epidermal growth factor receptor expression by RNA interference in A549 cells（论文提纲范文）
（1）2-芳基-4-芳甲胺基嘧啶类第四代EGFR抑制剂的设计、合成与抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 蛋白酪氨酸激酶与肿瘤的关系 |
| 1.2.1 蛋白酪氨酸激酶 |
| 1.2.1.1 受体型酪氨酸激酶 |
| 1.2.1.2 非受体型酪氨酸激酶 |
| 1.2.2 蛋白酪氨酸激酶与肺癌的关系 |
| 1.3 EGFR酪氨酸激酶 |
| 1.3.1 EGFR激酶的信号传导通路 |
| 1.3.1.1 配体的激活和二聚体的形成 |
| 1.3.1.2 受体酪氨酸激酶区的活化以及酪氨酸残基磷酸化 |
| 1.3.1.3 下游信号级联反应以及相关信号的传导 |
| 1.4 EGFR抑制剂的耐药机制 |
| 1.4.1 原发性耐药机制 |
| 1.4.2 获得性耐药机制 |
| 1.5 EGFR抑制剂研究进展 |
| 1.5.1 单克隆抗体 |
| 1.5.2 小分子EGFR抑制剂 |
| 1.5.2.1 第一代EGFR抑制剂 |
| 1.5.2.2 第二代EGFR抑制剂 |
| 1.5.2.3 第三代EGFR抑制剂 |
| 1.5.2.4 第四代EGFR抑制剂 |
| 1.5.2.5 其他类型的第四代EGFR抑制剂 |
| 1.6 选题的目的和意义 |
| 第2章 目标化合物的设计 |
| 2.1 先导化合物构效关系研究 |
| 2.2 含2-芳基-4-氨基喹唑啉结构的化合物的设计 |
| 2.3 含嘧啶甲胺取代喹唑啉结构的化合物的设计 |
| 2.4 含2-芳基-4-氨基噻喃并嘧啶结构的化合物的设计 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 目标化合物的合成 |
| 3.1 含2-芳基-4-氨基喹唑啉结构的化合物的合成 |
| 3.1.1 关键中间体3a-3b的合成 |
| 3.1.2 关键中间体5a-5k的合成 |
| 3.1.3 目标化合物ZZH-1~ZZH-38的合成 |
| 3.2 含嘧啶甲胺取代喹唑啉结构的化合物的合成 |
| 3.2.1 关键中间体9a-9f的合成 |
| 3.2.2 关键中间体10a-10f的合成 |
| 3.2.3 目标化合物ZZH-39~ZZH-46的合成 |
| 3.3 含2-芳基-4-氨基噻喃并嘧啶结构的化合物的合成 |
| 3.3.1 关键中间体14的合成 |
| 3.3.2 关键中间体15a-15h的合成 |
| 3.3.3 关键中间体16a-16h的合成 |
| 3.3.4 目标化合物ZZH-47~ZZH-62的合成 |
| 3.4 化合物合成小结 |
| 第4章 目标化合物的体外抗肿瘤活性与构效关系研究 |
| 4.1 含2-芳基-4-氨基喹唑啉结构的化合物的抗肿瘤活性与构效关系 |
| 4.1.1 含2-芳基-4-氨基喹唑啉结构的化合物的抗肿瘤活性结果 |
| 4.1.2 化合物对Ba/F3-EGFR~(Del19/T790M/C797S)细胞的体外抑制活性 |
| 4.1.3 体外激酶活性筛选 |
| 4.1.4 AO染色观察细胞形态 |
| 4.1.5 Axinnex V-FITC细胞凋亡实验 |
| 4.1.6 流式细胞术测定细胞周期实验 |
| 4.1.7 分子模拟对接研究 |
| 4.1.8 目标化合物的构效关系 |
| 4.1.9 小结 |
| 4.2 含嘧啶甲胺取代喹唑啉结构的化合物的抗肿瘤活性与构效关系 |
| 4.2.1 含嘧啶甲胺取代喹唑啉结构的化合物的抗肿瘤活性结果 |
| 4.2.2 体外激酶活性筛选 |
| 4.2.3 AO染色观察细胞形态 |
| 4.2.4 Axinnex V-FITC细胞凋亡实验 |
| 4.2.5 流式细胞术测定细胞周期实验 |
| 4.2.6 分子模拟对接研究 |
| 4.2.7 目标化合物的构效关系 |
| 4.2.8 小结 |
| 4.3 含2-芳基-4-氨基噻喃并嘧啶结构的化合物的抗肿瘤活性与构效关系 |
| 4.3.1 含2-芳基-4-氨基噻喃并嘧啶结构的化合物的抗肿瘤活性结果 |
| 4.3.2 部分化合物对H1975和Ba/F3-EGFR~(Del19/T790M/C797S)细胞的体外抑制活性 |
| 4.3.3 体外激酶活性筛选 |
| 4.3.4 AO染色观察细胞形态 |
| 4.3.5 Axinnex V-FITC细胞凋亡实验 |
| 4.3.6 流式细胞术测定细胞周期实验 |
| 4.3.7 化合物ZZH-61对A549细胞的荧光定量PCR分析 |
| 4.3.8 分子模拟对接研究 |
| 4.3.9 目标化合物的构效关系 |
| 4.3.10 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 目标化合物的设计与合成 |
| 5.1.1 目标化合物的设计 |
| 5.1.2 目标化合物的合成 |
| 5.2 目标化合物的体外抗肿瘤活性研究 |
| 5.3 目标化合物的构效关系研究 |
| 5.4 本课题的创新点 |
| 5.5 不足之处及展望 |
| 5.5.1 不足之处 |
| 5.5.2 展望 |
| 第6章 实验部分 |
| 6.1 含2-芳基-4-氨基喹唑啉结构的化合物的制备 |
| 6.1.1 中间体2a-2b的制备 |
| 6.1.2 关键中间体3a-3b的制备 |
| 6.1.3 中间体5a-5k的制备 |
| 6.1.4 目标化合物ZZH-1~ZZH-38的制备 |
| 6.2 含嘧啶甲胺取代喹唑啉结构的化合物的制备 |
| 6.2.1 中间体8a-8f的制备 |
| 6.2.2 中间体9a-9f的制备 |
| 6.2.3 目标化合物ZZH-39~ZZH-46的制备 |
| 6.3 含2-芳基-4-氨基噻喃并嘧啶结构的化合物的制备 |
| 6.3.1 中间体12的制备 |
| 6.3.2 中间体13的制备 |
| 6.3.3 中间体14的制备 |
| 6.3.4 中间体8a-8e的制备 |
| 6.3.5 中间体9a-9e的制备 |
| 6.3.6 中间体15a-15h的制备 |
| 6.3.7 中间体16a-16h的制备 |
| 6.3.8 目标化合物ZZH-47~ZZH-62的制备 |
| 6.4 药理实验 |
| 6.4.1 MTT法药物活性筛选 |
| 6.4.2 激酶活性评价 |
| 6.4.3 免疫荧光染色 |
| 6.4.4 Axinnex V-FITC细胞凋亡实验 |
| 6.4.5 流式细胞术测定细胞周期实验 |
| 6.4.6 荧光定量PCR分析 |
| 6.4.6.1 总RNA的提取 |
| 6.4.6.2 cDNA合成 |
| 6.4.6.3 实时荧光定量PCR反应 |
| 6.4.7 分子模拟对接研究 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读学位期间的研究成果及所获荣誉 |
| 致谢 |
（2）PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 非小细胞肺癌的诊断 |
| 1.1.3 非小细胞肺癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤-睾丸抗原(CTA)的研究进展 |
| 1.2.1 CTA分类及特征 |
| 1.2.2 CTA表达调控 |
| 1.2.3 CTA作用和功能 |
| 1.2.4 配子发生与恶性生殖 |
| 1.2.5 CTA在恶性肿瘤中的诊断价值 |
| 1.2.6 肿瘤疫苗和免疫治疗 |
| 1.3 人鱼精蛋白1(PRM1) |
| 1.3.1 PRM1 的作用 |
| 1.3.2 PRM1 与恶性肿瘤 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备和试剂 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验细胞和动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集 |
| 2.2.2 RT-PCTR法检测样本mRNA水平 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 细胞株复苏与培养 |
| 2.2.6 非小细胞肺癌细胞株活力检测 |
| 2.2.7 非小细胞肺癌细胞在不同血清浓度下孵育 |
| 2.2.8 质粒转染和RNA干扰 |
| 2.2.9 人源重组PRM1 蛋白孵育实验 |
| 2.2.10 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 EdU法检测细胞增殖实验 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PRM1 在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达 |
| 3.1.1 非小细胞肺癌肿瘤组织与配对正常组织PRM1-mRNA水平的差异 |
| 3.1.2 非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1 蛋白水平及临床相关性 |
| 3.1.3 非小细胞肺癌患者外周血中PRM1 蛋白水平及与临床特征的相关性 |
| 3.2 PRM1 诊断价值的评估 |
| 3.2.1 外周血PRM1 蛋白水平对非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.2.2 PRM1 在肺腺癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.3 PRM1 在肺鳞癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.4 PRM1 在组合标志物中诊断价值的评估 |
| 3.2.5 PRM1 对不同分期的非小细胞肺癌的诊断价值评估 |
| 3.2.6 PRM1 在Ⅰ-Ⅱ期肺鳞癌和肺腺癌中的诊断价值 |
| 3.3 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用的研究-细胞学实验 |
| 3.3.1 PRM1 在非小细胞肺癌细胞株中的表达 |
| 3.3.2 PRM1 基因过表达和敲低对非小细胞肺癌细胞株增殖的影响 |
| 3.3.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 细胞营养状态对PRM1 表达水平的影响 |
| 3.3.5 PRM1对A549、NCI-H460 细胞的细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用研究-动物学实验 |
| 3.4.1 构建A549 细胞裸鼠转移瘤模型 |
| 3.4.2 非小细胞肺癌细胞A549 转移瘤裸鼠血清中PRM1 表达水平 |
| 3.4.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤生长曲线的影响 |
| 3.4.4 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤体积和重量的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）FGF13调节A549细胞ROS生成及凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 肺癌概况 |
| 1.2 肿瘤细胞凋亡研究进展 |
| 1.3 成纤维细胞生长因子13 与肿瘤 |
| 1.3.1 成纤维细胞生长因子13 生物学功能 |
| 1.3.2 FGF13 与肿瘤的关系 |
| 1.4 活性氧在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.4.1 活性氧簇 |
| 1.4.2 ROS在肿瘤发生发展中的两面性 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第2 章 稳定干扰FGF13 的A549 细胞株的建立与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 TCGA数据库分析 |
| 2.2.2 蛋白质提取及Western blot |
| 2.2.3 FGF13 慢病毒干扰载体构建 |
| 2.2.4 慢病毒包装与收集 |
| 2.2.5 慢病毒感染及阳性克隆筛选 |
| 2.2.6 慢病毒干扰效率鉴定 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 FGF13 在肺癌细胞中高表达 |
| 2.3.2 FGF13 慢病毒干扰载体的构建 |
| 2.3.3 慢病毒的包装及阳性细胞株筛选 |
| 2.3.4 稳定干扰FGF13 的A549 细胞株的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3 章 FGF13 稳定干扰的A549 细胞转录组学分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 测序样品制备 |
| 3.2.2 转录组测序 |
| 3.2.3 数据处理及分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 差异表达基因数量统计分析 |
| 3.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 3.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 FGF13 调控A549 细胞中ROS的生成及机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株及质粒 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 FGF13 超表达效率鉴定 |
| 4.2.2 细胞内总ROS水平的检测 |
| 4.2.3 H_2O_2增加细胞内ROS |
| 4.2.4 细胞内线粒体ROS水平的检测 |
| 4.2.5 细胞中总GSH含量的测定 |
| 4.2.6 细胞中总SOD酶活力的测定 |
| 4.2.7 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FGF13 调控ROS的生成 |
| 4.3.2 FGF13 对线粒体ROS生成的影响 |
| 4.3.3 FGF13 抑制NOX4 生成的ROS |
| 4.3.4 FGF13 通过调控Nrf2 介导的抗氧化体系调节ROS的生成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 FGF13 通过ROS/Caspase-3 通路调控A549 细胞凋亡 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 荧光显微镜观察细胞凋亡 |
| 5.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 5.2.3 细胞内总蛋白质提取 |
| 5.2.4 Western blot |
| 5.2.5 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 荧光显微镜检测FGF13 对A549 细胞凋亡的影响 |
| 5.3.2 流式细胞术分析FGF13 对A549 细胞凋亡的影响 |
| 5.3.3 干扰FGF13 影响凋亡相关蛋白表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 主要实验试剂与耗材 |
| 附录1 主要实验试剂与耗材(续) |
| 附录2 实验仪器 |
| 攻读硕士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）糖基转移酶GALNT2调控肺腺癌放射抵抗的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要细胞系及来源 |
| 1.2 shRNA和siRNA序列及来源 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要试剂 |
| 1.6 主要溶液的配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 免疫组化 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 肺腺癌细胞放射抵抗模型的构建 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 细胞凋亡检测 |
| 2.7 细胞周期分析 |
| 2.8 克隆形成实验 |
| 2.9 Western bolt |
| 2.10 Lectin blot |
| 2.11 Lectin pull-down |
| 2.12 质谱 |
| 2.13 裸鼠成瘤实验 |
| 2.14 统计学数据分析 |
| 三、结果 |
| 1.GALNT2在肺腺癌组织中高表达并与患者不良预后相关 |
| 1.1 基于Oncomine和TCGA数据库分析GALNT2在肺腺癌中的表达水平及预后 |
| 1.2 免疫组化技术分析GALNT2在肺腺癌组织中表达情况及临床意义 |
| 2.GALNT2在肺腺癌放射抵抗细胞中特异性高表达 |
| 2.1 质谱筛选肺腺癌亲本细胞和放射抵抗细胞中差异蛋白 |
| 2.2 Western blot验证GALNT2的表达差异 |
| 3.GALNT2对肺腺癌细胞的放射抵抗具有调控作用 |
| 3.1 GALNT2过表达和基因沉默细胞模型的构建 |
| 3.2 过表达GALNT2促进肺腺癌细胞的放射抵抗 |
| 3.3 抑制GALNT2逆转肺腺癌细胞的放射抵抗 |
| 4.IGF-1R可作为GALNT2的下游靶向修饰糖蛋白 |
| 4.1 质谱筛选GALNT2的潜在糖基化底物 |
| 4.2 GALNT2对IGF-1R糖基化修饰具有调控作用 |
| 4.3 下调IGF-1R可逆转GALNT2介导的放射抵抗 |
| 5.下调GALNT2可增加肺腺癌荷瘤裸鼠的放射敏感性 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 文献综述 糖基化修饰改变与肿瘤放化疗抵抗 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文与成果 |
| 致谢 |
（6）circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.1 肺癌的危害性 |
| 1.2 环状RNA在肺癌等癌症中的功能 |
| 1.3 miR-558和其靶基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 circFOXP1在肺癌细胞中的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 circFOXP1竞争性吸附miR-558而促进下游靶基因TNFAIP1和TPM1的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌进展 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 综述 环状RNA在肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）羟基红花黄色素A对非小细胞肺癌增殖和迁移的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1.腺癌 |
| 2.鳞状细胞癌 |
| 3.大细胞癌 |
| 第1部分 HSYA对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验动物、试剂与设备 |
| 1.1.1 实验动物及细胞株 |
| 1.1.2 主要的实验试剂 |
| 1.1.3 主要的实验设备 |
| 1.1.4 主要的试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 CCK-8 法检测HSYA对肺癌细胞增殖的影响 |
| 1.2.3 CCK-8 法检测不同浓度HSYA处理对肺癌细胞增殖的影响 |
| 1.2.4 CCK-8 法检测HSYA处理不同时间对肺癌细胞增殖的影响 |
| 1.2.5 ki-67 免疫荧光法检测HSYA对肺癌细胞增殖的影响 |
| 1.2.6 统计学方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 HSYA对 A549和H1299 细胞增殖影响的浓度效应 |
| 1.3.2 HSYA对 A549和H1299 细胞增殖的影响的时间效应 |
| 1.3.3 HSYA对 A549和H1299 细胞中的Ki67 表达的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第2部分 HSYA通过调控EGF诱导的FAK,AKT通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 2.1 实验动物、试剂与设备 |
| 2.1.1 实验动物及细胞株 |
| 2.1.2 主要的实验试剂 |
| 2.1.3 主要的实验设备 |
| 2.1.4 主要的试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 Western blot检测HSYA对肺癌细胞中信号通路的影响 |
| 2.2.3 Westernblot检测PF-562271、EGF可以抑制和上调肺癌细胞中FAK/AKT磷酸化水平 |
| 2.2.4 Western blot检测HSYA可以抑制肺癌细胞中EGF诱导的FAK,AKT磷酸化水平 |
| 2.2.5 CCK-8 法检测HSYA可以通过调控EGF诱导的FAK,AKT通路抑制肺癌细胞的增殖 |
| 2.2.6 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HSYA对 A549及H1299 细胞FAK,AKT蛋白的表达和活化水平的影响 |
| 2.3.2 HSYA可以抑制肺癌细胞中EGF诱导的FAK,AKT磷酸化水平 |
| 2.3.3 HSYA通过调控EGF诱导的FAK,AKT通路抑制肺癌细胞的增殖 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3部分 HSYA对非小细胞肺癌细胞迁移的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 3.1 实验动物、试剂与设备 |
| 3.1.1 实验动物及细胞株 |
| 3.1.2 主要的实验试剂 |
| 3.1.3 主要的实验设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 划痕愈合实验 |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR检测HSYA对肺癌细胞相关分子的表达 |
| 3.2.4 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 不同浓度的HSYA对非小细胞肺癌细胞迁移的影响 |
| 3.3.2 HSYA可能通过下调MMP-2,MMP-9,VEGF的表达从而抑制迁移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文总结及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 羟基红花黄色素 A 药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
（8）利用超分辨成像研究非小细胞肺癌细胞膜Trop2蛋白分布及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 肺癌概述 |
| 1.1.1 肺癌流行病学 |
| 1.1.2 癌症相关细胞膜蛋白 |
| 1.1.2.1 肿瘤相关钙信号转导蛋白2(Trop2) |
| 1.1.2.1.1 Trop2的发现 |
| 1.1.2.1.2 Trop2的属性和功能 |
| 1.1.2.1.3 Trop2在癌症中的作用 |
| 1.1.2.1.4 Trop2在干细胞生物学和其他疾病中的作用 |
| 1.1.2.1.5 以Trop2为靶点的临床前治疗进展 |
| 1.1.3 肺癌的靶向治疗 |
| 1.2 超分辨显微成像技术概述 |
| 1.2.1 超分辨成像技术发展与原理 |
| 1.2.2 基于单分子定位的超分辨显微镜——dSTORM |
| 1.2.3 基于超分辨成像技术的荧光探针 |
| 1.2.3.1 荧光染料 |
| 1.2.3.2 荧光蛋白 |
| 1.2.3.3 荧光探针的选择 |
| 1.3 超分辨成像技术的相关研究示例 |
| 1.4 超分辨成像技术的未来展望 |
| 1.5 本论文的研究目的和主要内容 |
| 第2章 dSTORM研究Trop2在NSCLC细胞膜上的分布 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要常规实验仪器及耗材 |
| 2.2.2 超分辨成像系统的搭建 |
| 2.2.3 主要成品实验试剂 |
| 2.2.4 主要实验试剂配制及贮存 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞系培养 |
| 2.3.2 玻片清洗 |
| 2.3.3 新鲜人类原代肺癌组织和癌旁组织细胞的提取 |
| 2.3.4 dSTORM细胞样品的制备 |
| 2.3.5 dSTORM荧光图像的采集 |
| 2.4 实验数据处理 |
| 2.4.1 超分辨数据的图像构建与定位点密度计算 |
| 2.4.2 超分辨图像的分辨率评估——NanoJ-SQUIRREL |
| 2.4.3 基于定位点的超分辨显微数据分割和量化方法——SR-Tesseler |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 dSTORM采集原始图像帧数的确定 |
| 2.5.2 确定dSTORM实验中Trop2 的最佳标记浓度 |
| 2.5.3 Trop2分布假象的避免 |
| 2.5.4 dSTORM超分辨图像的分辨率测定 |
| 2.5.5 Trop2在不同NSCLC细胞膜表面的超分辨成像 |
| 2.5.6 Trop2在不同细胞系表面分布的量化分析 |
| 2.5.7 Trop2在人类原代肺癌细胞上的分布特征 |
| 第3章 应用dSTORM研究Trop2在细胞膜上的分布机制 |
| 3.1 细胞极性对Trop2 分布特征的影响及差异 |
| 3.1.1 概述 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 实验结果及讨论 |
| 3.2 脂筏结构对Trop2蛋白分布的影响 |
| 3.2.1 概述 |
| 3.2.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 实验结果及讨论 |
| 3.2.4.1 Trop2蛋白与脂筏结构的共定位 |
| 3.2.4.2 脂筏结构竭耗影响Trop2蛋白簇的形成 |
| 3.3 肌动蛋白骨架对Trop2分布特征的影响及差异 |
| 3.3.1 概述 |
| 3.3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.3.3 实验方法 |
| 3.3.4 实验结果及讨论 |
| 3.4 IGF-1 刺激对不同细胞膜上Trop2蛋白分布的影响 |
| 3.4.1 概述 |
| 3.4.2 实验仪器与试剂 |
| 3.4.3 实验方法 |
| 3.4.4 实验结果及讨论 |
| 第4章 破坏Trop2在细胞膜成簇对信号蛋白及细胞表型的影响 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 实验仪器与试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Western Blot实验流程 |
| 4.3.2 Transwell实验流程 |
| 4.3.3 细胞划痕实验流程 |
| 4.4 实验结果及讨论 |
| 第5章 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得学术成果 |
| 致谢 |
（9）SNCG对高糖环境下的肺癌细胞的作用及对ERK活化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词(Abbreviations) |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.2.1 细胞培养相关试剂及耗材 |
| 1.2.2 RT-PCR相关试剂及耗材 |
| 1.2.3 引物设计与合成 |
| 1.3 试剂制备 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1.1 细胞复苏 |
| 2.1.2 细胞换液 |
| 2.1.3 细胞传代 |
| 3.统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献（Reference） |
| 文献综述(Review) 高血糖对肿瘤进展的影响 |
| 1.新陈代谢的重新规划和分子改变 |
| 2.避免免疫破坏,增加肿瘤促发炎症 |
| 3.增殖和凋亡抑制作用 |
| 4.转移 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（10）细胞黏附分子2（CADM2）与非小细胞肺癌脑转移的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 细胞黏附分子2调控非小细胞肺癌脑转移的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 第二部分 细胞黏附分子2与非小细胞肺癌脑转移患者预后及临床因素的相关性分析 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 全文小结 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间科研情况 |
| 致谢 |
四、Inhibition of epidermal growth factor receptor expression by RNA interference in A549 cells（论文参考文献）
- [1]2-芳基-4-芳甲胺基嘧啶类第四代EGFR抑制剂的设计、合成与抗肿瘤活性研究[D]. 周志辉. 江西科技师范大学, 2021(12)
- [2]PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究[D]. 李小丰. 吉林大学, 2021(01)
- [3]FGF13调节A549细胞ROS生成及凋亡的机制研究[D]. 刘天宇. 陕西理工大学, 2021
- [4]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]糖基转移酶GALNT2调控肺腺癌放射抵抗的机制研究[D]. 夏敏. 湖北医药学院, 2021(01)
- [6]circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌进展的机制研究[D]. 毛勇. 南方医科大学, 2021(02)
- [7]羟基红花黄色素A对非小细胞肺癌增殖和迁移的作用及其机制[D]. 刘武胜. 南昌大学, 2021(01)
- [8]利用超分辨成像研究非小细胞肺癌细胞膜Trop2蛋白分布及其调控机制[D]. 付义林. 吉林大学, 2021(01)
- [9]SNCG对高糖环境下的肺癌细胞的作用及对ERK活化的影响[D]. 费晶. 石河子大学, 2021(02)
- [10]细胞黏附分子2（CADM2）与非小细胞肺癌脑转移的相关性研究[D]. 戴璐. 南方医科大学, 2021(02)