一、基因治疗中基因导入的三种非病毒感染方法（论文文献综述）
龙敏[1]（2021）在《肿瘤常见突变在肿瘤响应免疫治疗中的作用和机制研究》文中认为癌症是全球第二大死亡原因。继传统的手术治疗、放化疗和靶向疗法等治疗方式之后,免疫治疗特别是免疫检查点抑制剂的成功开启了癌症治疗的新纪元。然而大部分病人并不能有效响应免疫治疗,而且起初有疗效的病人也大多会复发。因此,我们迫切需要理解肿瘤的遗传异质性,寻找肿瘤细胞被免疫清除的软肋。基因突变累积是肿瘤的基本特征,它使得肿瘤细胞在发展过程中能够获得异常增殖和抵抗各种环境压力的能力,包括逃逸免疫治疗。为了探究肿瘤常见突变与肿瘤免疫治疗响应之间的相关性,我们设计并构建了靶向近300个肿瘤常见突变基因的小鼠guide RNA（gRNA）文库,将其导入小鼠结直肠癌细胞,并在免疫完整的小鼠皮下荷瘤模型中进行了体内CRISPR screen。通过分析比较经免疫检查点抑制剂anti-PD-1处理的肿瘤和对照肿瘤中的sgRNA分布变化,我们得到一系列与肿瘤免疫治疗响应相关的基因,其中包括5个已报道的突变后会导致肿瘤免疫治疗抗性的基因（Stk11、H2-K1、B2m、Pten和Smarca4）,以及10个有研究表明突变后能够增强肿瘤免疫治疗响应的基因（Kmt2d、Arid2、Lztr1、Pbrm1、Erbb3、Fat1、Ptpn11、Keap1、Smad4和Nras）。更为重要的是,我们还发现靶向Kdm6a基因的sgRNA在免疫检查点抑制剂处理的肿瘤中丰度显着降低。KDM6A蛋白是H3K27去甲基化酶,其与H3K4甲基转移酶KMT2D蛋白形成功能复合体,调控多个与发育和分化相关的基因的表达。通过构建不同的基因敲除小鼠细胞株,我们证明了Kmt2d基因或Kdm6a基因敲除能够显着提高肿瘤中T细胞的浸润水平,增强肿瘤细胞的抗原呈递,最终促进肿瘤对PD-1抑制剂的响应。进一步的机制研究显示,KMT2D和KDM6A蛋白对维持肿瘤细胞内H3K4me1水平和DNA损伤修复的完整性至关重要,其缺失使得肿瘤细胞对CD8+T细胞和干扰素、肿瘤坏死因子的杀伤更加敏感。TCGA临床数据分析也显示,免疫检查点抑制剂治疗能够显着改善带有KMT2D基因或KDM6A基因突变病人的生存。这些研究结果表明KMT2D基因突变和KDM6A基因突变具有作为肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的生物标志物的潜在价值。最后,我们进一步探索了KMT2D基因突变对肿瘤发展的影响。研究结果显示单一的Kmt2d基因突变不会促进肿瘤的发展,但会通过造成周围其它肿瘤细胞的生存劣势赋予突变细胞体内相对生存优势,其具体机制尚需进一步探索。总之,我们的研究为KMT2D和KDM6A基因突变作为指导临床治疗的生物标志物提供了理论依据,但要将其应用于临床推广还需更深入的机制研究。
邹昊玉[2]（2020）在《腺病毒介导白介素17A为靶点的抗体基因治疗抑制肝癌生长》文中研究指明在目前肝癌诊疗条件下,只有确诊为早期的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者（30%）可以接受治愈性疗法,而其余的中晚期以及复发的肝癌患者只能进行辅助治疗。现有肝癌辅助治疗手段有限,治疗效果不理想,接受辅助治疗病人的中位生存期（median overall survival,MS）少于6个月,所以,这类病人迫切需要更有效的治疗方法。基于病毒载体的基因治疗已被尝试用于肝脏疾病,并显示出了良好的应用前景。对病毒载体研究已较为透彻,尤其是5型腺病毒（Adenovirus type 5,Ad5）载体。在基因治疗临床试验中,该病毒载体是应用最多的载体类型,并且,5型腺病毒载体的嗜肝特性也使其在肝脏疾病治疗上具有独特的优势。基因治疗药物开发时,选择合适的靶点是决定治疗效果的关键因素之一。多项研究结果显示白介素17A（interleukin-17A,IL-17A）在肝癌进展中发挥了重要作用:肝癌患者肿瘤组织局部IL-17A的高表达与肿瘤进展、治疗效果差及预后不良关系密切;IL-17A能够通过增强肝癌细胞侵袭和迁移能力,增加肝肿瘤局部血管生成来促进肝癌生长。因此,在肝癌组织中阻止IL-17A的合成、促使其降解或封闭其活性将抑制肝癌的进展。基于上述假设以及5型腺病毒载体在基因治疗中的成熟应用,本课题旨在设计并开发以IL-17A为靶点,5型腺病毒为载体的肝癌基因治疗手段,并测试其应用于肝癌基因治疗的可行性及治疗效果。方法:将重组抗体片段的基因序列构建于5型腺病毒载体中,此重组抗体片段需要具备分泌功能、与IL-17A结合的能力并有较好的稳定性;病毒载体在局部给药后可以感染组织中的肿瘤细胞,然后促使重组抗体片段分泌到细胞外,中和肝癌组织局部过盛的IL-17A,达到治疗肝癌的效果。具体实施路径及方法如下:1)调取IL-17A中和抗体的重链可变区（variable regions of heavy chains,VH）和轻链可变区（variable regions of heavy chains,VL）用于重组抗体片段的构建。2)采用基因合成、同源重组、双质粒共转染法、Cs CI梯度超速离心法、壳蛋白免疫法进行载体质粒构建、病毒载体包装、浓缩纯化以及病毒滴度测定。3)采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）进行重组抗体片段的功能评价、稳定性评价及最优片段筛选。4)采用慢病毒感染肝癌细胞系后挑取单克隆的方法筛选得到高表达IL-17A的稳定肝癌细胞株;通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time-PCR,q RT-PCR）以及蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）进行表达检测IL-17A表达。5)采用流式检测法、transwell法、划痕法等进行基于稳定株的病毒载体体外评价。6)采用免疫缺陷小鼠皮下成瘤、免疫组化、小动物活体成像等方法进行病毒载体及重组抗体片段的体内表达、血管生成状况及肿瘤抑制效果评估。实验结果:（1）重组抗体片段设计、腺病毒载体构建及包装。1)本课题设计并合成了4种重组抗体片段,结构分别为sc Fv、sc Fv-sc Fv、sc Fv-CH3和sc Fv-Fc。2)重组抗体片段的基因序列分别插入腺病毒骨架质粒,得到载体质粒pse2784、pse2887、pse2888、pse2889。对插入的基因片段进行酶切鉴定,长度分别为1716 bp、1413bp、1818 bp、1020 bp与理论长度一致;基因测序的结果显示与设计100%一致,以上说明带有重组抗体片段的载体质粒构建成功。3)4种载体质粒分别与包装质粒共转染HEK293细胞进行病毒包装,质粒转染后7-21天内4种病毒载体相继出毒,滴度均在1010 Ifu/ml级别(Ad IL17-s滴度3.16×1010 Ifu/ml,Ad IL17-s C滴度3.93×1010 Ifu/ml,Ad IL17-ss滴度4.11×1010 Ifu/ml,Ad IL17-s F滴度9.48×1010Ifu/ml),满足实验需求。（2）重组抗体片段功能及稳定性检测。1)4种腺病毒载体感染细胞后收集上清,进行以IL-17A为抗原的ELISA检测,结果显示,4种重组抗体片段均具备分泌到细胞外的能力且具备与IL-17A结合的功能,其中Ad IL17-s F抗体效价高于1:1000。2)抗体稳定性检测结果显示,4种重组抗体在反复冻融8次后,Ad IL17-s F、Ad IL17-ss、Ad IL17-s F三组抗体片段与IL-17A依然具备较高结合力(Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s,****P>0.0001;Ad IL17-s C vs.Ad IL17-s,####P>0.0001;Ad IL17-ss vs.Ad IL17-s,????P>0.0001);在与血清37℃共孵育8天后,Ad IL17-s F组抗体片段稳定性高于其他三组(Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s,****P>0.0001;Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s C,####P>0.0001;Ad IL17-s F vs.Ad IL17-ss,?P>0.05)。最终得到结论:Ad IL17-s F组抗体片段sc Fv-Fc具有较好稳定性。（3）腺病毒载体Ad IL17-s F在体外对肝癌细胞功能的影响。1)本课题构建了高表达IL-17A稳定株Hep3B-IL17+和Huh-7-IL17+,在嘌呤霉素筛选及单克隆挑取后,与对照组相比,单克隆稳定株在m RNA水平及蛋白水均有IL-17A稳定表达,表明稳定株构建成功。2)稳定株Hep3B-IL17+和Huh-7-IL17+与对照组相比,细胞侵袭能力增强(Hep3B:IL17+vs.Control,****P<0.0001;Huh-7:IL17+vs.Control,***P<0.001);稳定株的迁移能力也要显着高于对照组细胞(Hep3B:IL17+vs.Control,***P<0.0001;Huh-7:IL17+vs.Control,***P<0.001)。在体外将腺病毒载体Ad IL17-s F作用于稳定株后,稳定株的细胞侵袭能力减弱(Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,**P<0.01;Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,**P<0.01),并且稳定株的迁移也得到抑制(Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,***P<0.001;Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,***P<0.001)。以上结果表明:腺病毒载体Ad IL17-s F能够在体外发挥作用,抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。（4）腺病毒载体Ad IL17-s F体内表达、抑制血管生成及抗肿瘤情况评估。1)活体成像结果显示5型腺病毒载体在瘤内注射后可持续表达32天以上(Ad-LUC vs.Control,****P<0.0001)。2)病毒载体在肿瘤原位注射后,重组抗体片段能够在肿瘤组织中表达(Ad IL17-s F vs.Control,****P<0.0001)。3)与对照组相比,给予Ad IL17-s F治疗后,肿瘤组织内的血管生成被抑制（Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）。4)与对照组相比,Ad IL17-s F治疗组的肿瘤生长受到抑制（Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05;Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）,肿瘤组织内的细胞凋亡增加（Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）。综上所述,本课题首次以IL-17A为靶点,构建了一种5型腺病毒载体Ad IL17-s F,用于肝癌治疗。此腺病毒载体在体外感染细胞后能够表达出重组抗体片段sc Fv-Fc,抗体片段具备IL-17A结合能力,在反复冻融及37℃血清共孵育8天后依然具备良好的稳定性;体外实验中,此病毒载体显示出对肝癌细胞侵袭和迁移的抑制;在体内给予腺病毒载体Ad IL17-s F治疗后,腺病毒载体能够感染肿瘤细胞,表达出抗体片段,抑制肿瘤组织局部的血管生成,并抑制肿瘤生长。本课题证明以IL-17A为靶点治疗肝癌能在一定程度上抑制肝癌生长;由此提供了一种以IL-17A为靶点的基因治疗策略,并证明了其有效性及可行性;这为以细胞因子为靶点的基因治疗方案设计提供了借鉴与新的思路。
沈阳坤[3]（2020）在《HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究》文中研究说明溶瘤病毒疗法（Oncolytic virus therapy,OVT）作为一种前景广阔的肿瘤治疗手段,具有安全、高效和副作用低的特点,已经成为肿瘤治疗研究中的热点。其中,I型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）作为研究最为广泛的一类溶瘤病毒,已有几十种候选药物处于临床前或临床研究阶段。然而,多年的临床试验表明,单一的溶瘤病毒疗法只有有限的治疗效果,且具体机制尚不明确。宿主中的一些蛋白质对病毒的侵染、繁殖以及传染至关重要,被称为病毒的宿主依赖因子（Host Dependency Factor,HDF）。已有证据表明,细胞和动物水平HDF的缺陷,会导致病毒的感染失败。然而尽管目前已有针对HSV-1复制周期及HSV-1的免疫机制等方面的深入研究,但对病毒与宿主间的相互作用的理解,特别是涉及病毒感染和裂解复制的细胞质蛋白的作用仍然所知甚少。此外,肿瘤患者体内的HDF突变是否影响HSV-1类溶瘤病毒的治疗尚未见系统研究。本论文研究的目的是探讨HSV-1病毒HDF突变在溶瘤病毒精准治疗中的作用及肿瘤耐受的机制。方法:（1）利用CRISPR/Cas9技术制备ICP34.5基因缺失的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-ΔICP34.5、HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌MC38细胞MC38Nectin1-/-和表达NEO-2/15的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15。（2）制备小鼠B16黑色素瘤模型和小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（3）制备小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5和HSV-1-NEO-2/15溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（4）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术筛选HSV-1病毒的HDF。（5）通过统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等方法确定HSV-1病毒HDF的候选基因。（6）利用CRISPR/Cas9技术制备Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6等基因的敲除细胞并通过病毒感染、台盼蓝法、细胞计数法、q PCR和Western Blotting检测HDF缺失对病毒感染的影响。（7）通过HSV-1病毒的膜结合实验评估HSV-1病毒的HDF缺失后病毒和宿主细胞的结合能力。（8）通过共聚焦显微镜追踪HSV-1病毒进入细胞的过程。（9）利用TCGA数据库分析临床肿瘤患者体内HSV-1病毒HDF的突变频率。结果:（1）HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗对小鼠MC38结肠癌治疗效果显着,然而对B16黑色素瘤未见明显效果。接着,我们利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌,结果显示,和对照组相比,Nectin1基因缺失的小鼠肿瘤体积未见明显缩小,证实溶瘤病毒对小鼠MC38-ΔNectin1结肠肿瘤的治疗无效。（2）本研究中,利用CRISPR基因编辑技术,我们成功制备HSV-1-NEO-2/15新型溶瘤病毒。通过对小鼠MC38结肠肿瘤的治疗,我们的研究结果表明,NEO-2/15不仅可以和HSV-1溶瘤病毒同时使用,并且NEO-2/15的整合能够显着增强溶瘤病毒的治疗效果。（3）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术,结合统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等分析方法,我们最终得到了31个HSV-1病毒的候选HDF基因。通个基因敲除验证,我们已经证实细胞水平敲除Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6可以显着增强细胞抵抗HSV-1病毒感染的能力。此外,KEGG分析结果表明EXT1、EXT2、EXTL3和B3GALT6等基因在硫酸乙酰肝素合成通路中扮演重要作用。基因敲除结果表明这些基因的突变不仅能够显着降低HSV-1病毒对宿主的感染水平,而且还能降低病毒与宿主细胞的结合能力。ENTPD1基因的缺失只影响HSV-1病毒进入宿主细胞,并不影响病毒与细胞膜的结合。（4）根据TCGA数据库提供的肿瘤患者基因信息,大部分基因在至少一种肿瘤中存在突变,且部分基因的突变频率高达5%以上,意味着HSV-1溶瘤病毒对这些肿瘤可能得不到很好的治疗效果,暗示HDF的精准检测在溶瘤病毒治疗前的必要性。结论:本研究中,基于HDF突变引起的溶瘤病毒感染失败的现象,我们首次提出溶瘤病毒抵抗（Oncolytic virus resistance）的概念,即当患者体内发生溶瘤病毒HDF的突变,溶瘤病毒的治疗效果就会消失;或者治疗前期溶瘤病毒对肿瘤的效果显着,但是随着肿瘤细胞增殖过程中异质性分化的更加明显,部分肿瘤细胞的HSV-1宿主依赖因子的表达水平降低或者发生基因突变,导致HSV-1病毒的感染减少或者失败,最终影响溶瘤病毒的治疗效果。基于此概念,寻找新的肿瘤治疗药物并用于溶瘤病毒的联合治疗是该治疗领域的一个重要研究方向。因此,我们构建了一种新型HSV-1类溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15,能显着增强肿瘤的治疗效果。此外,利用CRISPR全基因组敲除文库筛选出多个HSV-1的HDF,并深入探讨了部分基因的功能。近年来国内溶瘤病毒治疗的临床研究越来越多,而专门针对溶瘤病毒的精准医疗检测尚未见报道。本研究证实了根据HSV-1病毒HDF的突变与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗,以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。未来,通过对这些蛋白的深入研究,将为开发HSV-1类溶瘤病毒耐药检测试剂盒以及为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据。同时依据这些靶点,可以开发出新的抗HSV-1病毒药物,为溶瘤病毒治疗后因病毒残留带来的潜在感染风险提供新的解决方案,把溶瘤病毒治疗的副作用降到最低。
杨惠[4]（2020）在《绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究》文中指出绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）囊膜蛋白（Envelope,Env）可在体外诱导细胞转化、体内介导肿瘤形成。JSRVEnv如何打破宿主细胞平衡引起转化,需要从细胞稳态角度探讨致瘤机制。自噬（Autophagy）是维持细胞稳态的重要手段。截至目前,探讨JSRVEnv与自噬的研究仍是空白。因此,本研究旨在探讨JSRV Env转化细胞中自噬的相应变化,开展如下试验:1.针对自然感染OPA肺组织进行RNA-seq分析。结果显示:OPA肺组织中差异转录本与16个受细胞自噬调控的生物学功能模块相关,并与PI3K/Akt-mTOR、MAPK等调控自噬的信号转导通路高度关联。表明自噬可能参与OPA过程。2.JSRV env全基因序列同源重组入pCMV-dR8.91后包装、纯化。通过感染复数（multiplicity of infection,MOI）梯度试验,JSRV env慢病毒感染STCs最适MOI为5,感染NIH 3T3细胞最适MOI为30。表明JSRV env过表达慢病毒构建成功,并能感染STCs及NIH 3T3细胞。3.JSRV env慢病毒感染STCs及NIH 3T3细胞72h后,细胞增殖、迁移、侵袭能力均显着增强（p<0.05）,10d即可在软琼脂中形成明显集落。转化细胞注入裸鼠皮下 28d 形成明显肿瘤（STCs:1.94±0.83 cm3;NIH3T3:3.24±0.47cm3）。表明JSRV env慢病毒感染的STCs及NIH 3T3细胞发生转化。4.针对OPA肺组织和JSRVEnv转化细胞进行自噬因子检测,Beclin-1、p62表达量均显着下调（p<0.05）,LC3表达量下调。JSRV Env转化细胞内自噬体数量显着降低（p<0.05）。JSRV Env与Beclin-1在OPA肺组织中共定位,JSRV Env与Beclin-1在转化细胞中共沉淀。表明JSRVEnv转化细胞的自噬稳态降低,自噬体数量减少,且JSRVEnv与Beclin-1互作。5.当使用PepstatinA抑制自噬体与溶酶体融合,JSRV Env转化细胞中LC3Ⅱ可在短时期内大量积累。p62伴随转染时间延长（0-72h）而大量降解。表明JSRV Env转化细胞中存在完整的自噬流通。6.针对裸鼠成瘤模型（STCs:1.17±0.06 cm3;NIH 3T3:1.23±0.01 cm3）连续给予 3-MA（2mg/kg/d）和 RAPA（1mg/kg/d）28d。与对照组相比,3-MA 组及RAPA组肿瘤体积及重量均显着下调（p<0.05）。在STCs形成的JSRVEnv肿瘤中,3-MA组E-cadherin阳性信号显着大于对照组（p<0.05）,Vimentin 阳性信号显着小于对照组（p<0.05）。RAPA组E-cadherin与Vimentin 阳性信号与对照组相比均无显着差异。表明RAPA作为自噬激活剂及mTOR抑制剂,其对肿瘤进展的影响不仅取决于自噬调控,还可能与mTOR信号转导抑制相关。而3-MA是通过降低细胞自噬稳态影响细胞转化来抑制肿瘤进展。本试验揭示的OPA病肺组织差异表达基因能为未来筛选OPA潜在生物学标志物提供研究基础。本研究构建的JSRVEnv过表达慢病毒、JSRVEnv转化细胞及JSRVEnv裸鼠皮下移植瘤模型均能为今后探讨JSRVEnv分子致病机制提供稳定、高效的基础研究工具。本试验探讨的自噬在JSRVEnv转化细胞中的相应变化及相关作用,可为今后OPA的预防控制提供新思路。
林璐慧[5]（2020）在《miR-100靶向调控mTOR基因抑制套细胞淋巴瘤生长》文中认为目的:通过检测套细胞淋巴瘤（MCL）患者病理组织标本和MCL细胞株中miR-100和mTOR的表达,研究miR-100和mTOR在套细胞淋巴瘤细胞中的生物学功能,并探讨miR-100通过靶向调控mTOR的表达而抑制套细胞淋巴瘤生长的机制,为套细胞淋巴瘤的治疗提供新的靶点。方法:1、收集我院2016年9月～2018年12月病理诊断为套细胞淋巴瘤及增生性淋巴结炎患者的病理组织标本各18例。采用RT-PCR方法检测病理组织中miR-100 mRNA的表达水平,卡方检验分析MCL病理标本中miR-100 mRNA的表达与患者临床及病理资料的关系;采用western blot方法检测病理组织中mTOR蛋白的表达水平,应用线性拟合方法研究MCL患者病理标本miR-100 mRNA与mTOR蛋白的相关关系。2、采用RT-PCR方法检测3株套细胞淋巴瘤细胞系（Jeko-1、Mino、Granta-519）和正常淋巴细胞中miR-100和mTOR mRNA的表达水平,应用线性拟合方法研究MCL细胞株中miR-100与mTOR的相关关系。3、筛选出最佳沉默mTOR基因的干扰片段,并通过构建过表达miR-100的慢病毒和最佳mTOR干扰片段的慢病毒,转染Jeko-1和Mino细胞,采用RT-PCR方法分别检测过表达miR-100及干扰mTOR后miR-100及mTOR mRNA水平的变化。4、应用CCK-8法分别观察过表达miR-100或干扰mTOR后对Jeko-1和Mino细胞株细胞增殖的影响;流式细胞术检测过表达miR-100或干扰mTOR后对Jeko-1和Mino细胞株细胞凋亡及细胞周期G1、G2、S指数的影响。5、生物信息预测软件预测miR-100可以靶向mTOR基因以及mTOR mRNA转录本与miR-100的互补结合区,再构建mTOR野生型和突变型的荧光素酶报告载体,应用双荧光素酶实验进行靶基因验证miR-100与mTOR-3’UTR靶向结合。6、RT-PCR方法检测过表达miR-100后mTOR基因mRNA水平的变化,western blot检测过表达miR-100和干扰mTOR后mTOR蛋白水平的变化。7、在上调miR-100表达的基础上进行mTOR恢复表达实验,将miR-100过表达慢病毒载体和mTOR过表达质粒共转染Jeko-1和Mino细胞株,检测对mTOR mRNA和蛋白水平的影响以及对细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响,进一步验证miR-100在套细胞淋巴瘤中靶向调控mTOR抑制套细胞淋巴瘤的生长。结果:1.与增生性淋巴结炎相比,套细胞淋巴瘤患者病理组织中miR-100的mRNA水平明显的低表达（p<0.0001）,表达水平与其临床LDH水平和IPI评分有关,p<0.05。与患者年龄、性别、结外器官累及数、有无B症状、临床分期、肿瘤大小、骨髓浸润、合并白血病、Ki67等指标无关;套细胞淋巴瘤患者病理组织中mTOR的蛋白水平明显高表达（p=0.003）;表达与miR-100 mRNA的表达呈负相关（r=-0.9161,p<0.0001）。2.与正常淋巴细胞相比,三个套细胞淋巴瘤细胞株（Jeko-1、Mino、Granta-519）中miR-100 mRNA的表达水平较低（p<0.0001）,mTOR mRNA的表达水平较高（p<0.0001）,表达水平呈负相关（r=-0.9927,p<0.0001）。3.LV-miR-up能高效转染Jeko-1和Mino细胞,转染后可上调miR-100 mRNA的表达水平;LV-mTOR-RNAi能高效转染Jeko-1和Mino细胞,转染后可下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达水平;LV-miR-up和LV-mTOR-RNAi均能抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并使细胞周期阻滞在G1期,与对照组相比,差异均存在统计学意义。4.miRanda、Target Scan、Pic Tar三个生物信息分析软件共同预测了miR-100是靶向mTOR基因的miRNA以及mTOR mRNA转录本与miR-100的互补结合区在295-301位点。双荧光素酶实验结果表明miR-100过表达质粒可以抑制野生型3’UTR的mTOR报告质粒的luciferase的表达（p<0.0001）,不能抑制突变型3’UTR的mTOR报告质粒的luciferase的表达,验证了miR-100可与mTOR-3’UTR靶向结合。5.套细胞淋巴瘤细胞株过表达miR-100后可以下调mTOR的mRNA和蛋白的表达水平,通过mTOR过表达后可部分抵消过表达miR-100对mTOR基因的mRNA和蛋白的抑制,从而部分抵消过表达miR-100后抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及阻滞周期停滞于G1期的作用,且差异均有统计学意义。结论:1、在MCL病理标本及细胞系中miR-100低表达,mTOR高表达,两者呈负相关关系。2、在体外分别上调miR-100和下调mTOR后均可抑制MCL细胞增殖、诱导MCL细胞凋亡并可将MCL细胞的周期阻滞于G1期,miR-100可能是一个抑癌基因,mTOR可能是一个癌基因。3、miR-100通过靶向调控mTOR的表达抑制套细胞淋巴瘤生长而发挥肿瘤的效应。
岳冉[6]（2020）在《纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞》文中认为背景过继免疫疗法（adoptive immunotherapy,AIT）是近年来迅速发展的恶性肿瘤治疗方法,嵌合抗原受体（chmeric antigen receptor,CAR）修饰免疫细胞尤其取得显着成果。细胞免疫疗法的关键基于安全高效的基因转导方法,将目的基因导入胞内。基因转导有多种方法,目前常用的有慢病毒、逆转录病毒及电穿孔等,但转染效率有限、生物安全性低限制了其发展。阳离子聚合物纳米材料生物相容性好、易于修饰、制备简单、稳定性好,而作为极具潜力的基因载体进入人们的视线。本研究利用新型纳米载体mPEG-P（Asp-AED-g-HFB）（PAEF）介导PiggyBac转座子系统修饰自然杀伤（Natural kill,NK）细胞,实现了较高的基因转导效率,为肿瘤细胞免疫治疗提供了实验依据。目的探索新型阳离子聚合物纳米载体PAEF和PiggyBac转座子介导嵌合抗原受体修饰NK细胞的基因转染方法,为肿瘤细胞免疫治疗制剂研发提供新策略。方法1.制备PAEF/DNA（转座子+转座酶）复合物,通过Nano-ZSE动态光散射系统（Malvern Instruments）测量PAEF/DNA复合物的粒径分布和表面电位。2.DNA凝胶电泳验证PAEF的包封率、释放性和稳定性,结合粒径电位选择进入细胞合适的N/P值。3.CCK-8细胞毒性实验分析不同N/P值条件下PAEF/DNA复合物的细胞毒性。4.荧光显微镜及流式细胞术检测细胞转染效率,评估PAEF基因转染载体的可行性。结果1.PAEF/DNA复合物粒径电位测定显示PAEF可包裹DNA形成粒径100150nm的纳米复合物,有利于介导DNA进入细胞。2.DNA凝胶电泳显示,当PAEF/DNA复合物N/P值为20时,PAEF即可实现DNA的完全包裹;在还原剂二硫苏糖醇（dithiothreotol,DTT）存在的情况下,PAEF对DNA有良好的释放能力。3.CCK-8毒性实验表明N/P值为80时,PAEF/DNA复合物转染组的NK-92细胞存活率显着高于脂质体转染组([（72.5±3.9）%和（64.03±1.8）%,P<0.05]。4.PAEF/DNA复合物转染NK-92细胞48h,荧光显微镜下观察,N/P值80时,红色荧光蛋白（RFP）荧光多、荧光强度大;同样,在此N/P值条件下,流式细胞术显示达最高转染效率（83.4%）。传代培养10d,RFP仍能保持稳定的表达。结论1.本研究成功制备了新型阳离子聚合物纳米载体PAEF与DNA的复合物,经粒径及Zeta电位测量、DNA凝胶电泳包裹及释放实验均显示PAEF作为基因载体的可行性。2.PAEF/DNA复合物对NK-92细胞的细胞毒性明显较脂质体转染组低,说明生物相容性好,荧光显微镜及流式细胞术均显示转染效率较高,传代培养后荧光显微镜显示荧光仍有高表达。本研究建立了基于纳米载体的PiggyBac转座子介导的NK细胞基因转导方法,实现了较高的基因转导效率,为过继免疫治疗基因转导提供了试验依据。
靳红亮[7]（2020）在《基于GPI锚定双功能HIV进入抑制剂的基因治疗策略》文中研究说明自HIV病毒被鉴定发现以来,它一直作为一种严重危害全球公共健康的重大病原体,预防和治疗策略的研究一直在持续不断地进行。至今已有近40年的努力,安全有效的疫苗尚无问世,高效抗逆转录病毒治疗（HAART）依然是控制病毒感染的金标准治疗手段。由于HAART不能根除HIV,患者需要长期使用该疗法才能预防病毒相关免疫缺陷的出现。该疗法的局限性,如长期使用带来的毒副作用和耐药性问题,也愈来愈明显。因此,一种有效且低毒性的替代疗法已经成为了抗击HIV感染方面的研究重点和热点。目前,功能性治愈策略的研制是全球艾滋病治疗研究的重点。柏林病人和伦敦病人的成功已经证明了这种概念是可行的,并且提示基因治疗策略在实现HIV的功能性治愈方面具有非常大的前景。在基因治疗背景下,基因修饰的HIV抗性细胞也就成为了一种最具治疗潜力的手段。基于柏林病人和伦敦病人的思路,通过降低或消除细胞表面CCR5蛋白表达,多种靶向CCR5策略已经被用于生产HIV抗性（HIV-resistant）细胞。尽管靶向CCR5策略很难产生耐药性毒株,这种策略制备的HIV抗性细胞仍然允许X4嗜性和双嗜性（R5X4）病毒株的感染。因此,具有广谱和强效抗病毒特性的HIV靶细胞亟需研究。本课题旨在利用糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定平台将靶向病毒Env不同位点的进入抑制剂表达于HIV靶细胞表面,获得具有广谱抗病毒能力的细胞。首先,我们利用GPI锚工具将靶向gp41蛋白的短肽膜融合抑制剂2P23锚定和表达在靶细胞表面,并通过共聚焦实验证明GPI-2P23主要靶向在细胞膜表面脂筏区域。同时,FACS实验证明它的表达不影响细胞表面CD4、CCR5和CXCR4的表达水平。随后的活性评估实验证明了 GPI-2P23能有效保护靶细胞免受HIV-1、HIV-2和SIV病毒感染、并且也能有效阻止HIV-1病毒包膜蛋白介导的细胞膜融合和细胞间病毒的传播。此外,GPI-2P23修饰的CD4+T细胞能够完全抵抗R5嗜性和X4嗜性的HIV-1病毒感染,并能够在病毒复制的情况下表现出选择性存活优势。在进一步研究设计与GPI-2P23靶点不同的强效GPI锚定膜融合抑制剂过程中,我们探究了 GPI锚定膜融合抑制剂潜在的作用机制,发现主要有三个方面。一是PBD基序对于GPI锚定膜融抑制剂发挥抗病毒活性是至关重要的。二是Linker对于GPI锚定膜融合抑制剂不是必需的。三是首次证实了 GPI锚定膜融合抑制剂对病毒包膜蛋白的加工处理过程和子代病毒的感染性均有干扰作用,并且还发现含有PBD基序的GPI锚定膜融合抑制剂（尤其是GPI-CP41）的干扰能力更强。鉴于我们另一项研究发现的两个强效广谱的膜锚定进入抑制剂GPI-10E8（靶向gp41）和GPI-m36.4（靶向gp20）,且和膜锚定进入抑制剂GPI-CP41的作用位点不同。最后,为了研究膜锚定双功能进入抑制剂,基于GPI·锚定平台,多肽膜融合抑制剂（CP41）和广谱中和抗体（10E8或m36.4）融合至一个分子并表达在靶细胞表面。基于病毒感染试验和病毒包膜蛋白介导的细胞融合试验证实了 GPI-10E8-L-CP41、GPI-CP41-L-10E8 和 GPI-m36.4-L-CP41 是膜锚定双功能进入抑制剂。总之,本研究基于靶向HIV病毒包膜蛋白不同位点的进入抑制剂,成功构建了两类膜锚定双功能进入抑制剂,并证实了其制备广谱抗性的HIV靶细胞的能力,因此作为一种HIV基因治疗策略是非常具有治疗潜力的。
樊少臣[8]（2020）在《IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究》文中研究说明背景与目的胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率和致死率呈逐年上升趋势,严重威胁人类的生命与健康。由于胶质瘤细胞呈现浸润性生长,手术无法完全切除,因此,术后肿瘤容易复发。虽然过去几十年在胶质瘤治疗方面有了很多进展,包括放疗、化疗、免疫治疗等,但胶质瘤患者的总体预后仍然很差。近年来,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成为生物、医药研究领域的热点之一。MSCs是一类非造血干细胞,它具有高度自我更新、免疫调控及多向分化能力。MSCs在体外增殖迅速,细胞移植不易引起免疫排斥反应,且其能够向病变部位选择性迁移,因此,MSCs引起众多学者的广泛关注,但MSCs来源匮乏及取材不便等问题限制了其应用。脐带间充质干细胞（umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs）是从新生儿脐带中分离获得的MSCs,因其具有增殖能力强、采集方便、应用没有伦理问题等优点,被认为是近年来最具潜力的基因治疗载体。白介素-24（interleukin-24,IL-24）,又称为黑色素瘤分化相关基因7（melanoma differentiation-associated gene-7,MDA-7）,属于白介素-10家族,是一种多效的免疫调节因子。近年来的研究表明,IL-24可以诱导多种肿瘤细胞（胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等）的凋亡,但对正常细胞没有影响。因此,IL-24在肿瘤的基因治疗中有很好的应用前景。然而,IL-24半衰期短等不利因素限制了其临床应用。本研究拟利用UC-MSCs向肿瘤趋向性迁移的特性和IL-24强烈的抗肿瘤作用,以UC-MSC为基因治疗的载体,利用携带IL-24的慢病毒感染UC-MSCs,构建能够稳定表达并释放IL-24的IL-24-UC-MSCs,通过体外、体内实验观察其对胶质瘤的治疗效果,并探讨其可能的作用机制。方法（1）采用Len-GFP和Len-IL-24慢病毒转染UC-MSCs,构建空白对照UC-MSCs（GFP-UC-MSCs）和携带IL-24基因的UC-MSCs（IL-24-UC-MSCs）。通过倒置显微镜观察基因修饰前后UC-MSCs的形态;通过流式细胞仪检测基因修饰前后UC-MSCs细胞表面标记物CD29、CD105、CD34、CD45的表达;通过诱导分化实验检测基因修饰前后UC-MSCs向成骨细胞、脂肪细胞分化的情况,确定UC-MSCs在基因修饰后是否仍然保持间充质干细胞固有的生物学特性。（2）收集UC-MSCs、GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs全细胞裂解液,通过Western blot技术检测IL-24在其中的表达情况;收集IL-24-UC-MSCs不同时间点的培养上清,通过ELISA法检测IL-24在其中的表达水平。（3）将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs与胶质瘤U251细胞通过Transwell共培养,检测UC-MSCs在体外向胶质瘤细胞趋向性迁移的能力。（4）利用GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs的培养上清处理U251细胞48h,通过CCK-8实验观察U251细胞活力的变化。（5）将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs与U251共培养72 h,通过TUNEL法观察U251细胞凋亡情况。（6）构建裸鼠人胶质瘤皮下移植瘤模型,将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs移植入荷瘤裸鼠体内,观察UC-MSCs在体内对胶质瘤的趋向性迁移能力及治疗效果。（7）通过TUNEL法检测皮下移植瘤组织中细胞凋亡的情况,并通过免疫组化检测肿瘤组织中Akt/Bcl-2信号通路的分子变化,探讨其作用机理。结果（1）倒置显微镜下观察基因修饰前后UC-MSCs的形态可见:细胞呈现扁平的梭形,成簇或旋涡状排列,细胞膜清晰,细胞质丰富,胞核大,核仁清晰;流式细胞仪检测结果显示:基因修饰前后UC-MSCs细胞表面分子CD29、CD105、CD34、CD45的表达无明显变化;诱导分化实验结果显示:UC-MSCs在基因修饰前后均能向成骨细胞、脂肪细胞定向分化。（2）Western blot和ELISA实验结果显示:IL-24蛋白在IL-24-UC-MSCs中可以稳定表达,且表达水平随转染时间的延长而上升,在转染后72 h达到高峰（3345.4±211.837 pg/ml）。（3）体外Transwell迁移实验结果显示:不论是U251细胞还是其培养上清均可以诱导UC-MSCs向其趋向性迁移。（4）CCK-8实验结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs组、IL-24-UC-MSCs组U251细胞活力分别为0.82±0.06、0.68±0.04、0.37±0.05;IL-24-UC-MSCs组U251细胞的活力显着低于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。（5）TUNEL检测结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs组、IL-24-UC-MSCs组凋亡细胞所占比例分别为4.57±0.42、6.00±0.60、13.40±0.91;IL-24-UC-MSCs组凋亡细胞所占比例显着高于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。（6）体内抑瘤实验显示:移植入胶质瘤荷瘤裸鼠模型体内的GFP-UC-MSCs、IL-24-UC-MSCs可以迁移到肿瘤部位,且IL-24-UC-MSCs能够抑制肿瘤的生长,该组肿瘤体积显着小于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。（7）肿瘤组织的TUNEL检测结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs移植组、IL-24-UC-MSCs移植组肿瘤组织中细胞凋亡指数分别为:1.47±0.41、2.37±0.33、5.57±0.54;IL-24-UC-MSCs移植组细胞凋亡指数显着高于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。（8）免疫组化结果显示:IL-24-UC-MSCs移植组肿瘤组织中p-Akt、Bcl-2的表达水平显着低于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。结论本研究利用UC-MSCs向肿瘤细胞的趋向性迁移特性及IL-24强烈的抗肿瘤作用来治疗胶质瘤,显示了良好的实验效果。为UC-MSCs作为载体对胶质瘤进行靶向基因治疗提供了理论依据。得出以下结论:（1）采用Len-IL-24慢病毒转染UC-MSCs,可以构建稳定表达并分泌IL-24的IL-24-UC-MSCs,且不改变UC-MSCs的基本生物学特性。（2）IL-24-UC-MSCs在体外和体内均有向胶质瘤细胞迁移的特性,且对胶质瘤细胞生长具有抑制作用。（3）IL-24-UC-MSCs在体内通过调节Akt/Bcl-2信号通路来诱导胶质瘤细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。
宋孟秋[9]（2020）在《蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌生长中的作用及其抑制剂的筛选》文中研究指明背景与目的食管癌（Esophageal cancer,EC）是我国常见的恶性肿瘤之一,占世界食管癌发病的53%,成为第四大癌症死亡原因,在亚洲和非洲的某些地区高度流行。食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是食管癌最主要的病理组织学类型,每年约占食管癌总发病率的90%。在中国,食管鳞癌发病具有显着的地域特色,多集中在中国中北部及太行山脉一带,如林州市（河南）和涉县（河北）等。目前,手术结合放化疗的方法是食管鳞癌临床治疗的常用手段,5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇是临床常用的食管鳞癌化疗药物,然而,食管鳞癌的发病率仍然在持续上升,不良反应不断出现,术后5年生存率也只有15%～25%,因此,阐明食管鳞癌的发病机制,寻找新的作用靶点,筛选靶向抑制剂,对改善食管鳞癌的治疗现状,提高临床治疗效率,降低疾病带来的痛苦与损失以及提升病人5年生存率,均具有重要的科学意义。PI3-K/AKT/mTOR通路参与癌症转化的机制包括增强细胞增殖与存活、促进细胞侵袭或转移等。AKT蛋白是PI3-K激酶的直接下游分子,可将信号传递至下游100余种底物蛋白,是PI3-K通路的关键节点之一。AKT是一个重要的信号中枢,在多种癌症的发生发展过程中起着决定性的作用,其功能的发挥影响细胞代谢、生长、存活和增殖等多种生理过程。AKT已经被证实在结肠癌、乳腺癌等癌症中通过调控多种信号通路发挥促癌功能,是一个具有潜力的治疗靶点。在食管鳞癌中,AKT分子的功能及作用机制仍然需要系统性研究。有丝分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路是促进肿瘤发生发展的一条重要信号通路。TAOs处于p38 MAPK上游,在p38 MAPK级联信号通路中属于MAP3Ks家族,具有1001个氨基酸残基,可以调节G蛋白偶联受体家族信号通路、细胞骨架的稳定性和细胞存活力,并可在DNA损伤机制中激活p38从而调控细胞周期。抑制TAOK1蛋白功能可以加强中心体富集化的乳腺癌细胞中心体的解聚并破坏有丝分裂,揭示了 TAOK1成为乳腺癌治疗潜在靶标的可能性。目前,TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的功能尚不清楚,在食管鳞癌中靶向TAOK1激酶的抑制剂也未见报道,因此,研究TAOK1在食管鳞癌中的作用机制并筛选靶向该蛋白的天然小分子抑制剂,有望为食管鳞癌的研究与治疗提供新的作用靶标和治疗思路。天然小分子抑制剂,是一类从植物中提纯出的具有生物活性的化合物,如类胡萝卜素、类黄酮、花青素等。近年来,一些天然化合物被报道具有调节信号转导通路、调控细胞周期、抑制细胞分化和促进凋亡相关基因表达的能力,具有良好的抗癌活性。目前,广泛应用于肿瘤临床治疗的天然小分子药物有紫杉醇、喜树碱（类）、长春碱（类）、人参皂苷Rg3和高三尖杉酯碱等,均取得了有效的治疗效果。因此,筛选并研究靶向蛋白激酶AKT及TAOK1的天然小分子抑制剂,对食管鳞癌的临床预防与治疗具有指导意义。在本论文中,我们分别对蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌中的功能进行了深度研究,探讨AKT和TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的相关功能及分子机制,明确了其在食管鳞癌中的促癌作用,并评价了通过抑制蛋白激酶AKT与TAOK1的功能来治疗食管鳞癌的意义与可行性。在此基础上,借助Kinase Profiling assay和超级计算机分子对接模型,分别筛选到了 AKT蛋白的天然小分子抑制剂冬凌草甲素和TAOK1蛋白的天然小分子抑制剂白藜芦醇,并通过蛋白下拉、激酶实验、SPR技术等一系列分子生物学和PDX动物模型来进行验证,最终明确了冬凌草甲素和白藜芦醇分别通过靶向AKT和TAOK1蛋白激酶来抑制食管鳞癌的分子机制和研究发现。方法1.通过免疫组织化学法检测AKT蛋白在食管正常组织和癌组织中表达量的变化;采用免疫组织化学法结合蛋白免疫印迹技术评价TAOK1在食管鳞癌组织和细胞中的表达水平;2.采用基因敲减和过表达技术研究AKT蛋白在食管鳞癌中的功能;采用基因沉默、蛋白过表达结合MTT、Soft agar、流式细胞术等技术检测TAOK1在食管鳞癌细胞中的相关功能;3.将AKT特异性小分子抑制剂MK-2206处理细胞,评价MK-2206通过调控AKT功能抑制食管鳞癌的可行性;4.采用CDX或PDX的方法进一步验证TAOK1蛋白在食管鳞癌移植瘤模型中的作用;5.采用Kinase Profiling assay筛选到了 AKT蛋白的天然小分子抑制剂冬凌草甲素,采用激酶实验、蛋白下拉实验并结合ATP竞争性结合实验研究冬凌草甲素与AKT的体外结合机制及IC50值;通过分子对接模型模拟冬凌草甲素分别与AKT1和AKT2蛋白的结合位点及结合模式;6.采用超级计算机模拟程序筛选与TAOK1亲和指数较高的天然小分子化合物并运用MTT比色法筛选该化合物在食管鳞癌中的IC50剂量;通过激酶实验、SPR技术、KINOME ScanTM技术、蛋白下拉以及分子对接模型,验证小分子抑制剂与TAOK1蛋白激酶的结合模式及结合位点;7.采用MTT比色法和Soft agar实验检测天然小分子抑制剂冬凌草甲素和白藜芦醇对食管鳞癌细胞体外增殖的影响;8.采用流式细胞术结合蛋白免疫印迹法检测冬凌草甲素对食管鳞癌细胞周期和凋亡的影响;采用流式细胞术结合蛋白免疫印迹法检测白藜芦醇对食管鳞癌细胞凋亡的影响;9.采用双荧光素酶报告基因法结合蛋白免疫印迹法检测冬凌草甲素对PI3-K/AKT信号转导通路的影响;采用蛋白免疫印迹法检测白藜芦醇对TAOK1调控p38 MAPK信号通路的影响;10.采用人源肿瘤异种移植瘤（PDX）模型,观察冬凌草甲素和白藜芦醇口服给药后分别对食管鳞癌PDX的生长的影响。结果1.p-AKT（Ser473）和AKT蛋白在食管鳞癌组织中显着过表达;AKT在食管鳞癌中发挥促癌基因的功能,其过表达可促进细胞增殖,基因沉默可抑制癌细胞的体外生长;2.MK-2206通过抑制AKT激酶活性显着性降低食管鳞癌细胞的体外增殖;3.冬凌草甲素在食管鳞癌细胞中特异性靶向AKT并显着抑制AKT1和AKT2激酶的体外活性,IC50值分别为8.4±1.34 μM（AKT1）和8.9 ±0.29μM（AKT2）;4.冬凌草甲素通过ATP竞争性模式与AKT1激酶的Asp292氨基酸残基形成两个氢键而结合,与AKT2激酶的Asp293及Lys277氨基酸残基分别形成一个氢键而结合;5.冬凌草甲素通过靶向AKT1/2蛋白激酶显着抑制食管鳞癌细胞的体外增殖和克隆的形成,阻滞细胞周期G2/M期进展并促进细胞凋亡,下调PI3-K/AKT信号转导通路并显着抑制食管鳞癌PDX模型的生长;6.TAOK1蛋白在食管鳞癌组织和细胞中过表达,在晚期食管鳞癌组织中过表达现象尤为明显;7.TAOK1基因沉默显着抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆的形成,将细胞周期阻滞在G1期,并下调p38 MAPK信号通路;TAOK1基因沉默显着抑制食管鳞癌CDX及PDX的生长;TAOK1蛋白过表达促进食管鳞癌细胞的体外增殖及克隆形成能力,促进细胞周期进展,并上调p38 MAPK信号通路;TAOK1蛋白过表达促进食管鳞癌CDX的生长;8.在超级计算机对接得到的候选天然小分子化合物中,白藜芦醇在食管鳞癌细胞中具有最小的IC50值;9.白藜芦醇对TAOK1蛋白激酶具有极高的亲和力和极小的解离常数,在食管鳞癌中特异性靶向TAOK1并显着抑制TAOK1激酶的体外活性;10.白藜芦醇有效抑制食管鳞癌细胞的体外增殖、克隆的形成并诱导细胞凋亡的发生;白藜芦醇通过靶向TAOK1蛋白激酶显着抑制食管鳞癌PDX的生长并下调相关MAPK通路。结论1.AKT蛋白激酶在食管鳞癌组织中过表达,其基因敲减或过表达可分别抑制或促进食管鳞癌细胞的增殖,在食管鳞癌中发挥促癌功能。2.冬凌草甲素以ATP竞争性模式与AKT蛋白激酶结合并抑制其活性。3.冬凌草甲素通过靶向AKT蛋白抑制食管鳞癌细胞的体外增殖、周期进展并促进凋亡的发生,通过抑制PI3-K/AKT信号转导通路显着减弱食管鳞癌PDX的生长。4.TAOK1蛋白在食管鳞癌组织和细胞中过表达,作为促癌基因促进食管鳞癌细胞的增殖、细胞周期进展并调控p38 MAPK信号通路。5.白藜芦醇在食管鳞癌中特异性靶向TAOK1并显着抑制TAOK1激酶的体外活性。6.白藜芦醇通过靶向TAOK1有效抑制食管鳞癌细胞的体外增殖,诱导细胞凋亡的发生,下调p38 MAPK信号通路并显着性减弱食管鳞癌PDX的生长。
王立正[10]（2019）在《衣壳修饰型溶瘤腺病毒设计及其治疗恶性胶质瘤的研究》文中进行了进一步梳理恶性胶质瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM）是最高发的颅内恶性肿瘤,患者平均生存期不足15个月。由于其发生位置的特殊性及复杂的生物学特性,传统的手术、化疗及放疗很难完全将其治愈。近年来,溶瘤病毒疗法作为一种恶性肿瘤治疗的新型疗法被广泛关注。据统计目前至少有14项应用溶瘤病毒治疗恶性胶质瘤的方案开展了临床研究,使用的溶瘤病毒类型包括腺病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒等,其中应用最多的病毒类型为腺病毒。目前开发的溶瘤腺病毒大多是由人5型腺病毒（Ad5）改造而来,又称为条件复制型Ad5（CRAd5）。Ad5感染细胞依赖于病毒的纤维蛋白（fiber）结合细胞表面的柯萨奇-腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor,CAR）,实现病毒在细胞上的锚定。而CAR在胶质瘤细胞中通常低水平表达,正常组织细胞的CAR表达量普遍高于胶质瘤细胞,这将导致腺病毒对胶质瘤细胞的靶向感染性不强,严重限制了溶瘤腺病毒在恶性胶质瘤治疗中的应用。另外,由于血脑屏障的存在及病毒自身感染性质的限制,包括溶瘤腺病毒在内的、进入临床研究阶段的溶瘤病毒对恶性胶质瘤治疗的给药方式均为瘤内（颅内）给药。这种给药方式病毒的扩散受限,不能有效感染距离给药位置较远的肿瘤细胞。因此,对于极易多中心发生、侵袭性强、易复发转移的恶性胶质瘤而言,瘤内给药的方式治疗效果有限。针对上述问题,本论文的主要目的为:利用基因工程手段对溶瘤腺病毒衣壳进行修饰,改变溶瘤腺病毒的感染性质,增加溶瘤病毒对恶性胶质瘤细胞的靶向感染能力,并希望构建一种更适合于静脉全身给药治疗恶性胶质瘤的溶瘤腺病毒载体。迄今为止,已经发现数十种血清型的人腺病毒,归属于7个亚群。不同亚群的腺病毒感染性质不同,如C亚群的Ad5感染依赖CAR,而来自D亚群的Ad37则通过唾液酸（SA）感染细胞。唾液酸是神经发育过程中的重要分子,在脑内大量表达,并且有研究报道唾液酸的表达量与肿瘤的恶性程度相关。因此,我们假设:若将CRAd5识别受体的纤维蛋白头节区（knob）替换为Ad37的knob（Ad37-knob,K37）,构建fiber嵌合型溶瘤腺病毒,或可改变溶瘤腺病毒的感染性质,使其可以通过唾液酸作为受体感染细胞,此嵌合病毒将有潜力更高效地感染并溶解胶质瘤细胞。另外,我们还期待该策略能够增强溶瘤腺病毒穿透血脑屏障的能力。本论文第一部分工作即围绕此假设展开。经过病毒骨架质粒构建、病毒包装筛选及纯化等步骤,我们成功构建Ad37-knob替换型溶瘤腺病毒（CRAd5/K37）。通过体内外研究探明了Ad37-knob替换策略可改变溶瘤腺病毒的感染途径,并证明了此策略可显着提升溶瘤病毒对胶质瘤细胞的感染能力（提升十数倍）。而后,对CRAd5/K37血脑屏障穿透能力进行评价,结果显示:CRAd5/K37相比于衣壳未经修饰的CRAd5,能更高效地穿透体外血脑屏障模型的细胞屏障;而在颅内荷瘤小鼠及正常Balb/c小鼠中,静脉注射后CRAd5/K37未见更多的脑内富集。这一现象可能的原因有两个:（1）鼠源细胞唾液酸表达量显着低于对应人源细胞,可能由于人鼠细胞唾液酸的表达差异造成体外人细胞模型中结果与小鼠体内结果不统一。小鼠模型可能不是评价Ad37-knob替换型腺病毒组织分布的合适动物模型。若要进一步明确Ad37-knob替换策略是否能有效提升溶瘤腺病毒血脑屏障穿透能力,可能需要选择更接近于人的动物模型,如灵长类猴模型等。（2）单一knob替换策略可能不足以大幅提升溶瘤腺病毒的脑靶向能力,或许可以通过进一步修饰实现溶瘤病毒的脑靶向。本论文第二部分拟在Ad37-knob替换的基础上,通过在CRAd5/K37的knob区域尝试插入可同时靶向血脑屏障及胶质瘤的双级靶向肽,以期进一步提升溶瘤腺病毒对血脑屏障及恶性胶质瘤的双级靶向能力。通过文献调研,我们首先选择了5种在非病毒载体或其他病毒载体上可成功介导脑靶向的5种靶向肽,并参考Ad5-knob的靶向肽插入位点,设计了10种在Ad37-knob HI loop环或C末端插入靶向肽的修饰形式（K37-peptide）。但在研究中发现:所有K37-peptide蛋白在大肠杆菌中表达效率均远低于未经靶向肽修饰的K37蛋白。而后,成功构建了4种pAd5/K37-peptide腺病毒骨架质粒,但分别与穿梭质粒共转染HEK293均不能成功包装出病毒。最后,我们构建了嵌合fiber（F5/K37及10种F5/K37-peptide）真核表达质粒,转染细胞后,所有F5/K37-peptide的表达均远低于F5/K37的表达效率。至此,我们推断:Ad37-knob的HI loop环及C末端不允许双级靶向肽插入,其具体原因和机制需要未来进一步的研究。除fiber外,腺病毒衣壳蛋白pⅨ同样是腺病毒衣壳修饰的理想位点。实验室前期构建了一种pⅨ的C端通过亮氨酸拉链的二聚作用修饰有肿瘤坏死因子相关凋亡配体（Tμmour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）的溶瘤腺病毒载体（A4）。A4病毒在乳腺癌动物模型中表现出非常好的肿瘤靶向性及抑瘤效果。本论文第三部分工作即结合TRAIL表面修饰策略及Ad37-knob替换策略构建一种衣壳双修饰型溶瘤腺病毒（A4/K37）,以期使溶瘤腺病毒对恶性胶质瘤具有更好的感染能力及感染选择性。所设计的A4/K37不仅具有Ad37-knob的替换及pⅨ上TRAIL蛋白修饰两种衣壳修饰,还携载TRAIL基因,可介导TRAIL蛋白的表达增强肿瘤杀伤能力。通过病毒包装、筛选及纯化,成功获得A4/K37病毒后,对其基因组及结构性质鉴定,并且分析体外感染性质,最后在荷瘤小鼠中评价了其抑瘤效果。综合本部分结果发现:双修饰策略能够优化病毒对胶质瘤细胞的感染效率及感染选择性;并且A4/K37相比于A4病毒,具有更好的胶质瘤杀伤能力。双修饰策略相比于单修饰策略,能够实现更高效率的复制溶瘤及效力更强的TRAIL基因治疗。综上所述,本论文先后尝试了“Ad37-knob替换”、“Ad37-knob替换基础上靶向肽修饰”及“Ad37-knob替换联合pⅨ上TRAIL修饰的双修饰策略”三种溶瘤腺病毒衣壳修饰策略,以期提升溶瘤腺病毒治疗恶性胶质瘤的潜力。经过实验探究,得出结论:“Ad37-knob替换策略”可改变溶瘤腺病毒的感染性质,使其更适合应用于恶性胶质瘤的治疗;而基于Ad37-knob替换基础上的靶向肽修饰,由于嵌合纤维蛋白的表达受到影响,导致无法包装出病毒;以“双修饰策略”构建的溶瘤腺病毒载体具有更高效的条件复制溶瘤能力,并介导更好的TRAIL基因治疗效果,在恶性胶质瘤的治疗中具有较好的应用前景。
二、基因治疗中基因导入的三种非病毒感染方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因治疗中基因导入的三种非病毒感染方法（论文提纲范文）
（1）肿瘤常见突变在肿瘤响应免疫治疗中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 癌症的特征 |
| 1.1.1 癌症的特性 |
| 1.1.2 肿瘤中的突变 |
| 1.1.3 肿瘤的异质性 |
| 1.2 癌症的治疗 |
| 1.2.1 传统治疗方式 |
| 1.2.2 靶向治疗 |
| 1.2.3 免疫治疗 |
| 1.3 肿瘤细胞免疫逃逸和免疫治疗抗性 |
| 1.3.1 肿瘤细胞免疫逃逸的主要机制 |
| 1.3.2 免疫治疗抗性 |
| 1.3.3 提升免疫治疗效果的方法探索 |
| 1.4 CRISPR技术和CRISPR文库筛选(CRISPR screen) |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9系统 |
| 1.4.2 CRISPR技术的开发与应用 |
| 1.4.3 CRISPR screen的发展与应用 |
| 1.5 KMT2D简介 |
| 1.5.1 KMT2D蛋白与其功能复合体 |
| 1.5.2 KMT2D蛋白生物学功能 |
| 1.5.3 KMT2D基因突变与疾病 |
| 1.6 KDM6A简介 |
| 1.6.1 KDM6A蛋白 |
| 1.6.2 KDM6A蛋白生物学功能 |
| 1.6.3 KDM6A基因突变与疾病 |
| 1.7 本研究拟解决的科学问题 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 mDriver sgRNA文库靶向基因 |
| 2.1.6 sgRNA PCR引物序列 |
| 2.1.7 质粒和细菌 |
| 2.1.8 实验仪器 |
| 2.1.9 常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法与流程 |
| 2.2.1 sgRNA质粒文库构建 |
| 2.2.2 病毒包装 |
| 2.2.3 病毒滴度测定 |
| 2.2.4 MC38细胞系小鼠皮下肿瘤模型CRISPR Screen |
| 2.2.5 基因敲除细胞系构建 |
| 2.2.6 蛋白质免疫印记(Western Blot) |
| 2.2.7 小鼠肿瘤浸润免疫细胞(TILs)分析 |
| 2.2.8 小鼠OT-1 CD8+T细胞分离与细胞毒性测定 |
| 2.2.9 RNA-seq流程与数据分析 |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR技术 |
| 2.2.11 ATAC-seq流程与数据分析 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 采用体内CRISPR screen探究肿瘤常见突变与肿瘤免疫治疗响应的相关性 |
| 3.1.1 靶向肿瘤常见突变基因的sgRNA文库构建 |
| 3.1.2 体内CRISPR screen |
| 3.1.3 体内CRISPR screen数据分析 |
| 3.1.4 候选基因的确定 |
| 3.2 已知候选基因的表型验证及机制探索 |
| 3.2.1 Anti-PD-1治疗能够有效抑制Arid2基因敲除的MC38小鼠结直肠癌肿瘤的发展 |
| 3.2.2 Anti-PD-1治疗能够显着提高Arid2基因敲除的MC38肿瘤中的免疫细胞浸润水平 |
| 3.3 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除对肿瘤响应免疫检查点抑制剂的影响 |
| 3.3.1 Kmt2d基因敲除能够显着增强MC38小鼠结直肠癌对免疫检查点抑制剂的响应 |
| 3.3.2 Kmt2d基因敲除能够显着提高MC38肿瘤中T细胞的浸润水平 |
| 3.3.3 Kdm6a基因敲除能够显着增强MC38小鼠结直肠癌对免疫检查点抑制剂的响应 |
| 3.3.4 Kdm6a基因敲除能够显着提高MC38肿瘤中T细胞的浸润水平 |
| 3.3.5 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除对MC38肿瘤中基因表达的影响及其共性 |
| 3.3.6 Kmt2d基因敲除能够促使B16-F10小鼠黑色素瘤响应免疫检查点抑制剂治疗 |
| 3.3.7 Kmt2d基因敲除能够显着提高B16-F10肿瘤中的免疫细胞浸润水平 |
| 3.3.8 Kdm6a基因敲除对B16-F10小鼠黑色素瘤响应免疫检查点抑制剂无显着影响 |
| 3.3.9 Kdm6a基因敲除对B16-F10小鼠黑色素瘤肿瘤微环境无显着影响 |
| 3.4 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除影响肿瘤免疫检查点抑制剂响应的机制探索 |
| 3.4.1 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除能够增强肿瘤细胞对细胞毒性T细胞杀伤的敏感性 |
| 3.4.2 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除对肿瘤细胞表面MHC I表达水平和抗原呈递的影响 |
| 3.4.3 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除能够增强肿瘤细胞对干扰素和肿瘤坏死因子杀伤的敏感性 |
| 3.5 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除对MC38 肿瘤模型的基因表达及其它功能的影响 |
| 3.5.1 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除会抑制MC38 肿瘤的基因表达.. |
| 3.5.2 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除会抑制肿瘤细胞的DNA损伤修复 |
| 3.6 KMT2D基因和KDM6A基因突变作为病人免疫检查点抑制剂响应的生物标志物的可行性探索 |
| 3.6.1 KMT2D、KDM6A、ARID2、PBRM1基因在多种肿瘤类型中均有较高的突变频率 |
| 3.6.2 KMT2D、KDM6A、ARID2、PBRM1基因突变与病人免疫治疗响应程度的相关性分析 |
| 3.7 Kmt2d基因敲除对肿瘤发展的影响及其机制探索 |
| 3.7.1 Kmt2d基因敲除对小鼠结直肠癌MC38肿瘤细胞在体内环境下发展的影响 |
| 3.7.2 Kmt2d基因敲除对小鼠肝癌Hepa1-6肿瘤细胞体内环境生存适应性的影响 |
| 3.7.3 Kmt2d基因敲除赋予肿瘤细胞相对生存优势的机制探索 |
| 4 结论总结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 研究肿瘤常见突变对肿瘤治疗的意义 |
| 5.2 Kmt2d基因和Kdm6a基因敲除增强肿瘤免疫检查点抑制剂响应的深层机制探索 |
| 5.3 Kmt2d基因与Kdm6a基因敲除在B16-F10模型中的表现不同的探讨 |
| 5.4 Kmt2d基因敲除赋予肿瘤细胞相对生存优势的深层机制探讨 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辨决议书 |
（2）腺病毒介导白介素17A为靶点的抗体基因治疗抑制肝癌生长（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 原发性肝癌流行病学 |
| 1.1.2 肝癌诊疗系统概述 |
| 1.1.3 肝癌的治疗药物 |
| 1.1.4 肝癌的基因治疗现状 |
| 1.1.5 抗体治疗与抗体基因治疗 |
| 1.1.6 肝脏环境与肝癌发病机制 |
| 1.1.7 IL-17A是肝癌治疗的潜在靶点 |
| 1.2 课题设计与研究内容 |
| 1.2.1 课题设计 |
| 1.2.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体质粒的构建 |
| 2.2.2 腺病毒包装及纯化 |
| 2.2.3 病毒滴度测定 |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 抗体物理稳定性评价 |
| 2.2.6 抗体体内模拟稳定性评价 |
| 2.2.7 慢病毒载体质粒构建 |
| 2.2.8 慢病毒载体包装及纯化 |
| 2.2.9 慢病毒滴度测定 |
| 2.2.10 高表达IL-17A的肝癌稳定株构建 |
| 2.2.11 免疫印记(Western Blot) |
| 2.2.12 细胞增殖的检测 |
| 2.2.13 细胞凋亡检测 |
| 2.2.14 细胞侵袭检测 |
| 2.2.15 细胞划痕实验 |
| 2.2.16 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.2.17 免疫组化 |
| 2.2.18 稳定株裸鼠肝癌皮下成瘤模型建立及腺病毒载体给药方案 |
| 2.2.19 小鼠活体成像 |
| 2.2.20 数据统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 抗体片段设计、腺病毒载体构建及包装 |
| 3.1.1 抗IL-17A重组抗体片段设计 |
| 3.1.2 携带分泌型抗IL-17A抗体片段序列的载体质粒构建及鉴定 |
| 3.1.3 抗IL-17A抗体片段在mRNA水平的表达 |
| 3.1.4 腺病毒载体包装 |
| 3.2 重组抗体片段功能及稳定性检测 |
| 3.2.1 抗体表达及结合能力验证 |
| 3.2.2 抗体物理稳定性 |
| 3.2.3 抗体体内稳定性 |
| 3.3 AdIL17-sF在体外对肝癌细胞功能的影响 |
| 3.3.1 常用肝癌细胞系IL-17A的表达情况 |
| 3.3.2 高表达IL-17A的肝癌稳定株构建及检测 |
| 3.3.3 AdIL17-sF对细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 AdIL17-sF对细胞凋亡的影响 |
| 3.3.5 AdIL17-sF对细胞侵袭能力的影响 |
| 3.3.6 AdIL17-sF对细胞迁移能力的影响 |
| 3.4 AdIL17-sF体内表达、抑制血管生成及抗肿瘤情况评估 |
| 3.4.1 腺病毒载体在肿瘤组织内表达持续情况 |
| 3.4.2 抗IL-17A抗体片段在肿瘤组织表达情况 |
| 3.4.3 AdIL17-sF对Huh-7-IL17~+小鼠模型的肿瘤抑制作用 |
| 3.4.4 AdIL17-sF对Hep3B-IL17~+小鼠模型的肿瘤抑制作用 |
| 3.4.5 AdIL17-sF抑制皮下肿瘤血管生成 |
| 3.4.6 AdIL17-sF对肿瘤组织内细胞凋亡影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 第六章 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 文章涉及的基因序列 |
| 伦理审查说明 |
| 作者简历及科研成果 |
| 致谢 |
（3）HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 疱疹病毒概述 |
| 1.1 疱疹病毒的分类 |
| 1.2 单纯疱疹病毒 |
| 2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.1 溶瘤病毒的种类 |
| 3 CRISPR/Cas9 系统概述 |
| 3.1 CRISPR/Cas9 系统的分子机制 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 系统在HSV-1 病毒基因改造中的应用 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 HSV-1 溶瘤病毒治疗小鼠恶性肿瘤 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 仪器耗材 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 细胞转染 |
| 1.3.3 HSV-1 病毒的扩增与保存 |
| 1.3.4 HSV-1 对细胞增殖影响的曲线制备 |
| 1.3.5 HSV-1 对细胞存活影响的曲线制备 |
| 1.3.6 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因改造溶瘤病毒 |
| 1.3.7 图像分析和数据统计 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 制备ICP34.5 缺失的HSV-1 溶瘤病毒 |
| 1.4.2 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠黑色素瘤的治疗效果 |
| 1.4.3 多种细胞系对HSV-1-ΔICP34.5 病毒的敏感性分析 |
| 1.4.4 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.4.5 Nectin1 缺失抵抗HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗 |
| 1.4.6 HSV-1-NEO2/15 溶瘤病毒制备 |
| 1.4.7 HSV-1-NEO-2/15 溶瘤病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 利用全基因组CRISPR-Cas9敲除文库进行HSV-1宿主依赖因子的筛选及富集 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 仪器耗材 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 材料 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 2.3.3 Western Blot验证敲除细胞株 |
| 2.3.4 细胞免疫荧光 |
| 2.3.5 慢病毒包装 |
| 2.3.6 细胞总RNA提取 |
| 2.3.7 cDNA的合成 |
| 2.3.8 cDNA的普通PCR反应 |
| 2.3.9 病毒结合实验 |
| 2.3.10 图像分析和数据统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 制备L929 全基因组细胞敲除文库 |
| 2.4.2 利用全基因组敲除库筛选抗HSV-1 的细胞 |
| 2.4.3 筛选后抗病毒细胞对HSV-1 病毒的敏感性分析 |
| 2.4.4 筛选过程中sg RNA以及其靶向基因的动力学变化 |
| 2.4.5 PANTHER GO富集度分析 |
| 2.4.6 富集HSV-1 病毒的宿主依赖因子 |
| 2.4.7 临床肿瘤患者体内HSV-1 病毒HDF的突变频率分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 HSV-1 宿主依赖因子候选基因的验证与分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 仪器耗材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 3.3.2 利用PANTHER网站分析基因功能 |
| 3.3.3 利用KEGG网站分析目的基因通路关系 |
| 3.3.4 图像分析和数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Nectin1和ENTPD1 基因缺失对病毒的抵抗 |
| 3.4.2 ENTPD1 基因是一个HSV-1 病毒新的宿主依赖因子 |
| 3.4.3 敲除ENTPD1对HSV-1 感染后病毒增殖的影响 |
| 3.4.4 ENTPD1 缺失抵抗HSV-1 感染不依赖I型干扰素通路 |
| 3.4.5 ENTPD1 缺失阻止HSV-1 病毒进入细胞,但不影响病毒和细胞膜结合 |
| 3.4.6 BGC-823 细胞缺失ENTPD1 基因抵抗HSV-1 感染 |
| 3.4.7 其他HSV-1 病毒HDF候选基因验证与分析 |
| 3.4.8 硫酸乙酰肝素合成途径对HSV-1 进入细胞至关重要 |
| 3.4.9 KEGG通路分析 |
| 3.4.10 确定硫酸乙酰肝素合成途径候选基因 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 OPA国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.2.1 OPA的分布 |
| 1.2.2 OPA人工感染模型及JSRV啮齿动物模型构建 |
| 1.2.3 OPA的预防和控制 |
| 1.3 JSRV国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.3.1 JSRV的复制 |
| 1.3.2 JSRV的致瘤机制 |
| 1.4 细胞自噬国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.4.1 细胞自噬的分类 |
| 1.4.2 细胞自噬形成过程与自噬相关基因(ATG)调控 |
| 1.4.3 病毒感染与细胞自噬 |
| 1.4.4 肿瘤与细胞自噬 |
| 1.4.5 自噬研究方法 |
| 1.4.6 调节自噬作用的相关药物 |
| 1.5 本研究拟解决的关键问题 |
| 1.6 本研究的意义 |
| 1.7 本试验技术路线 |
| 2 试验一 自然感染绵羊肺腺瘤肺组织的转录组测序分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试验分析软件 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 自然感染OPA病理解剖学和组织病理学特征 |
| 2.2.2 自然感染OPA病例JSRV Env的表达检测 |
| 2.2.3 OPA和健康羊肺组织高质量测序数据的产生和筛选 |
| 2.2.4 自然感染OPA和健康对照之间的转录本比较概况 |
| 2.2.5 DEGs的GO富集分析 |
| 2.2.6 DEGs的KEGG富集分析 |
| 2.2.7 自然感染OPA中上调和下调功能模块分析 |
| 2.2.8 通过RT-qPCR验证RNA-Seq结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 典型OPA病例筛选 |
| 2.3.2 转录组数据分析处理 |
| 2.3.3 差异表达基因筛选 |
| 2.3.4 DEGs富集的生物学功能 |
| 2.3.5 DEGs富集的信号转导通路 |
| 2.3.6 OPA分子致癌机制 |
| 2.4 小结 |
| 3 试验二 JSRV env慢病毒表达载体的构建及最佳转染效率测试 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞与载体 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 重组慢病毒载体构建 |
| 3.2.2 JSRV env重组慢病毒包装 |
| 3.2.3 纯化的重组慢病毒滴度测定 |
| 3.2.4 JSRV env慢病毒感染STCs及NIH 3T3细胞 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 OPA病原分离与复制 |
| 3.3.2 基因过表达基本方式 |
| 3.3.3 慢病毒载体与真核质粒的比较 |
| 3.3.4 JSRV env过表达载体优势 |
| 3.4 小结 |
| 4 试验三 慢病毒介导JSRV env过表达对细胞增殖及迁移侵袭的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 试剂与耗材 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 |
| 4.2.2 细胞划痕试验 |
| 4.2.3 Transwell侵袭试验 |
| 4.2.4 琼脂糖克隆形成试验 |
| 4.2.5 裸鼠成瘤试验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 JSRV Env引起的细胞增殖作用 |
| 4.3.2 JSRV Env引起的细胞转化 |
| 4.3.3 JSRV Env引起的皮下肿瘤 |
| 4.4 小结 |
| 5 试验四 JSRV Env转化细胞相关自噬因子及自噬体检测 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验组织及细胞 |
| 5.1.2 抗体 |
| 5.1.3 试验耗材及仪器 |
| 5.1.4 试验试剂 |
| 5.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 5.1.6 试验方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 OPA肺组织自噬因子表达分布 |
| 5.2.2 OPA肺组织自噬因子Western blotting检测 |
| 5.2.3 JSRV Env过表达细胞自噬因子Western blotting检测 |
| 5.2.4 JSRV Env与Beclin-1互作 |
| 5.2.5 透射电镜观察JSRV Env转化细胞中的自噬体 |
| 5.2.6 CYTO-ID(?)自噬检测试剂盒检测自噬体 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 细胞自噬因子检测 |
| 5.3.2 自噬体的观察研究 |
| 5.3.3 细胞自噬与病毒感染 |
| 5.4 小结 |
| 6 试验五 JSRV Env转化细胞自噬流通状态检测 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验细胞 |
| 6.1.2 抗体 |
| 6.1.3 试验耗材及仪器 |
| 6.1.4 试验试剂 |
| 6.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 6.1.6 试验方法 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 P62降解试验 |
| 6.2.2 LC3 Ⅱ turnover试验 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 细胞自噬流的检测 |
| 6.3.2 自噬与细胞稳态 |
| 6.3.3 病毒感染与细胞自噬流变化 |
| 6.4 小结 |
| 7 试验六 雷帕霉素及3-甲基腺嘌呤调控细胞自噬影响JSRV Env肿瘤形成 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验组织及细胞 |
| 7.1.2 抗体 |
| 7.1.3 试验耗材及仪器 |
| 7.1.4 试验试剂 |
| 7.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 7.1.6 试验方法 |
| 7.2 试验结果 |
| 7.2.1 JSRV Env皮下移植瘤模型构建 |
| 7.2.2 裸鼠腹腔给药试验 |
| 7.2.3 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤Western blotting检测 |
| 7.2.4 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤病理组织学观察 |
| 7.2.5 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤免疫组织化学观察 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 肿瘤的发生发展 |
| 7.3.2 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤生成 |
| 7.3.3 肿瘤与细胞自噬 |
| 7.3.4 细胞自噬在肿瘤治疗中的应用 |
| 7.4 小结 |
| 8 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）miR-100靶向调控mTOR基因抑制套细胞淋巴瘤生长（论文提纲范文）
| 附录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 miR-100和mTOR在套细胞淋巴瘤中的表达水平 |
| 引言 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 慢病毒过表达miR-100载体构建、包装及转染 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 慢病毒干扰mTOR载体构建包装及筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 miR-100 及其靶基因mTOR在套细胞淋巴瘤中的功能鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 miR-100 靶向调控MCL中 mTOR基因的验证实验 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNA在淋巴瘤中的作用及其意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:PiggyBac转座子系统及CAR-NK细胞在肿瘤免疫治疗中的进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）基于GPI锚定双功能HIV进入抑制剂的基因治疗策略（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一部分 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 软件 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 抗体 |
| 1.1.5 其他试剂和耗材 |
| 1.1.6 质粒 |
| 1.1.6.1 用于制备HIV-1、HIV-2和SIV病毒的质粒 |
| 1.1.6.2 用于制备慢病毒的质粒 |
| 1.1.6.3 用于表达GPI锚定膜融合抑制剂的表达质粒 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 重组慢病毒的制备及滴度测定 |
| 1.2.2 稳定表达外源基因(GPI锚定抗病毒分子)的HIV靶细胞系的构建 |
| 1.2.3 FACS分析外源基因在稳转HIV靶细胞系中的表达 |
| 1.2.4 Confocal鉴定外源基因定位于细胞脂筏区域 |
| 1.2.5 假型病毒(HIV-1、SIV和VSV-G)和复制型病毒(HIV-1和HIV-2)的制备 |
| 1.2.6 测定假型病毒和复制型病毒的滴度 |
| 1.2.7 评价外源基因在HIV靶细胞中的抗病毒能力 |
| 1.2.8 HIV-1包膜蛋白介导的细胞融合试验 |
| 1.2.9 HIV-1细胞间传播试验 |
| 1.2.10 FACS分析外源基因在HIV-1病毒生产细胞系中的表达 |
| 1.2.11 评价HIV-1病毒在表达外源基因的生产细胞系中的生产情况及其感染能力 |
| 1.2.12 Western blotting分析外源基因在HIV-1病毒生产细胞系中的表达对病毒包膜糖蛋白前体gp160加工处理的影响 |
| 1.2.13 Western blotting分析外源基因在HIV-1病毒生产细胞系的表达对病毒包膜糖蛋白gp41亚基掺入至病毒颗粒的影响 |
| 第二部分 膜锚定强效HIV膜融合抑制剂的构建及抗病毒活性的评价 |
| 结果 |
| 2.1 GPI锚介导抗病毒多肽在细胞膜上脂筏区域的表达 |
| 2.2 GPI-2P23修饰后的TZM-bl细胞有效地抵抗不同亚型的HIV-1病毒、HIV-2病毒和SIV病毒的感染 |
| 2.3 GPI-2P23修饰后的TZM-bl细胞有效地抵抗T20耐药性病毒感染 |
| 2.4 GPI-2P23能有效地阻止HIV-1包膜蛋白介导细胞间融合 |
| 2.5 GPI-2P23能有效地阻止细胞间病毒传播 |
| 2.6 GPI-2P23修饰后的人源CD4~+T细胞抵抗HIV-1病毒感染 |
| 2.7 GPI-2P23修饰后的CEMss-CCR5细胞在HIV-1感染细胞中具有选择性存活和增殖优势 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 膜锚定HIV膜融合抑制剂作用机制的研究 |
| 结果 |
| 3.1 GPI-CP28的构建及其抗病毒活性的评估 |
| 3.2 PBD序列对于GPI锚定膜融合抑制剂发挥抗病毒作用是非常关键的 |
| 3.3 Linker对于GPI锚定膜融合抑制剂不是必需的 |
| 3.4 GPI锚定膜融合抑制剂在HIV-1生产细胞系HEK293T中的表达 |
| 3.5 GPI锚定膜融合抑制剂限制子代病毒的释放并抑制其感染能力 |
| 3.6 GPI锚定膜融合抑制剂干扰病毒包膜蛋白的加工处理过程 |
| 3.7 GPI锚定膜融合抑制剂抑制病毒包膜蛋白gp120和gp41掺入到病毒颗粒 |
| 3.8 GPI-CP41修饰后的人CD4~+T细胞抵抗不同嗜性的HIV-1病毒感染 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 膜锚定双功能进入抑制剂的研究 |
| 结果 |
| 4.1 以gp41为靶标构建GPI锚定CP41和10E8双功能进入抑制剂 |
| 4.1.1 构建GPI锚定CP41和10E8双功能进入抑制剂 |
| 4.1.2 基于细胞融合试验,验证GPI锚定CP41和10E8是强效的双功能进入抑制剂 |
| 4.2 以gp120和gp41靶标构建GPI锚定m36.4和CP41双功能进入抑制剂 |
| 4.2.1 构建GPI锚定m36.4和CP41双功能进入抑制剂 |
| 4.2.2 基于细胞融合试验,验证GPI锚定m36.4和CP41是强效的双功能进入抑制剂 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五部分 全文总结 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 研究中的不足和有待进一步解决的问题 |
| 发表论文 |
| 综述 HIV基因和细胞治疗策略研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 IL-24-UC-MSCs的构建及鉴定 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 溶液的配制 |
| 1.2.4 UC-MSCs |
| 1.2.5 实验慢病毒 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 UC-MSCs的培养 |
| 1.3.2 细胞的冻存与复苏 |
| 1.3.3 慢病毒感染UC-MSCs |
| 1.3.4 基因修饰对UC-MSCs细胞形态学的影响 |
| 1.3.5 基因修饰对UC-MSCs细胞表面分子标记物的影响 |
| 1.3.6 基因修饰对UC-MSCs多向分化能力的影响 |
| 1.3.7 Western blot检测IL-24 表达 |
| 1.3.8 ELISA法检测IL-24 表达 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 慢病毒感染UC-MSCs |
| 1.4.2 基因修饰对UC-MSCs细胞形态学的影响 |
| 1.4.3 基因修饰对UC-MSCs细胞表面分子标记物的影响 |
| 1.4.4 基因修饰对UC-MSCs多向分化能力的影响 |
| 1.4.5 基因修饰后UC-MSCs中 IL-24 的表达 |
| 1.5 讨论 |
| 1.5.1 UC-MSCs的培养 |
| 1.5.2 UC-MSCs的转染及鉴定 |
| 1.5.3 目的基因的检测 |
| 1.6 结论 |
| 第二部分 基因修饰的UC-MSCs治疗胶质瘤的实验研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 溶液的配制 |
| 2.2.4 UC-MSCs |
| 2.2.5 人胶质瘤U251 细胞 |
| 2.2.6 实验慢病毒 |
| 2.2.7 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 UC-MSCs的培养与病毒感染 |
| 2.3.2 U251 细胞的培养 |
| 2.3.3 细胞的冻存与复苏 |
| 2.3.4 IL-24-UC-MSCs在体外向肿瘤细胞的趋向性迁移实验 |
| 2.3.5 IL-24-UC-MSCs对 U251 细胞活力的影响 |
| 2.3.6 IL-24-UC-MSCs诱导U251 细胞凋亡的体外实验 |
| 2.3.7 U251 胶质瘤荷瘤裸鼠模型的建立 |
| 2.3.8 胶质瘤荷瘤裸鼠的细胞移植 |
| 2.3.9 肿瘤生长情况 |
| 2.3.10 病理标本的制备 |
| 2.3.11 IL-24-UC-MSCs在体内向肿瘤趋向性迁移的检测 |
| 2.3.12 Western blot检测IL-24 的体内表达 |
| 2.3.13 胶质瘤组织HE染色 |
| 2.3.14 IL-24-UC-MSCs在体内对胶质瘤细胞凋亡的影响 |
| 2.3.15 p-Akt、Bcl-2 的免疫组化检测 |
| 2.3.16 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 IL-24-UC-MSCs在体外向肿瘤细胞的趋向性迁移 |
| 2.4.2 IL-24-UC-MSCs分泌的IL-24 在体外抑制U251 细胞活力 |
| 2.4.3 IL-24-UC-MSCs分泌的IL-24 在体外诱导U251 细胞凋亡 |
| 2.4.4 IL-24-UC-MSCs抑制裸鼠皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 IL-24-UC-MSCs在体内向肿瘤细胞的趋向性迁移 |
| 2.4.6 IL-24 在皮下移植瘤组织中的表达 |
| 2.4.7 IL-24-UC-MSCs诱导皮下移植瘤组织中细胞凋亡 |
| 2.4.8 p-Akt、Bcl-2 在肿瘤组织中的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 基因修饰的UC-MSCs向胶质瘤细胞的趋向性迁移 |
| 2.5.2 IL-24 基因修饰的UC-MSCs在体外抑制胶质瘤 |
| 2.5.3 IL-24 基因修饰的UC-MSCs在体内抑制胶质瘤 |
| 2.5.4 Akt/Bcl-2 信号通路与胶质瘤 |
| 2.5.5 后续思考 |
| 2.6 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 综述 间充质干细胞及其在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 在攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 在攻读博士学位期间主持和参加的科研项目 |
| 在攻读博士学位期间参加的学术交流 |
| 致谢 |
（9）蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌生长中的作用及其抑制剂的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 冬凌草甲素通过靶向AKT蛋白激酶从体内外抑制食管鳞癌的机制研究 |
| 第一部分 研究AKT蛋白激酶在食管鳞癌中的生物学功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 AKT蛋白在食管鳞癌组织中的表达高于正常组织 |
| 2.2 研究AKT蛋白激酶在食管鳞癌中的功能 |
| 2.3 AKT特异性抑制剂MK-2206抑制食管鳞癌细胞的体外增殖 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 研究冬凌草甲素靶向并抑制AKT激酶的能力 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 冬凌草甲素可与AKT蛋白结合 |
| 2.2 冬凌草甲素抑制AKT蛋白激酶的活性 |
| 2.3 冬凌草甲素抑制AKT1/2蛋白激酶的IC50活性检测 |
| 2.4 冬凌草甲素以ATP竞争性模式抑制AKT1/2蛋白激酶的活性 |
| 2.5 冬凌草甲素与AKT1/2激酶呈ATP竞争性动力学反应模式 |
| 2.6 冬凌草甲素与AKT1和AKT2蛋白的结合模式 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 研究冬凌草甲素通过靶向AK对食管鳞癌的抑制效应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 低浓度冬凌草甲素对食管正常上皮细胞无细胞毒性 |
| 2.2 冬凌草甲素抑制食管鳞癌细胞的增殖 |
| 2.3 冬凌草甲素阻滞食管鳞癌细胞周期的进展 |
| 2.4 冬凌草甲素促进食管鳞癌细胞的凋亡 |
| 2.5 冬凌草甲素通过靶向AKT蛋白激酶抑制食管鳞癌细胞的增殖 |
| 2.6 冬凌草甲素在食管鳞癌细胞中下调PI3-K/AKT信号通路 |
| 2.7 冬凌草甲素抑制食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)模型的生长 |
| 2.8 冬凌草甲素对食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)模型小鼠的体重无影响 |
| 2.9 冬凌草甲素对食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)模型小鼠无肝脾毒性 |
| 2.10 冬凌草甲素在食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)组织中降低相关标志物的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 本章结论 |
| 第二章 TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的机制研究及天然小分子抑制剂筛选 |
| 第一部分 研究TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TAOK1蛋白在食管鳞癌组织中的表达高于正常组织或癌旁组织 |
| 2.2 TAOK1蛋白与食管鳞癌肿瘤分期呈正相关 |
| 2.3 p-TAOKs及TAOK1蛋白在不同食管鳞癌细胞中的表达高于正常食管上皮细胞 |
| 2.4 TAOK1基因沉默抑制食管鳞癌 |
| 2.5 研究TAOK1蛋白过表达对食管鳞癌的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 筛选TAOK1蛋白激酶的天然小分子抑制剂 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 与TAOK1高度亲和的天然小分子抑制剂 |
| 2.2 候选天然小分子抑制剂在食管鳞癌细胞增殖中具有不同的活性 |
| 2.3 白藜芦醇高度亲和TAOK1蛋白激酶 |
| 2.4 白藜芦醇与TAOK1蛋白激酶结合后不易解离 |
| 2.5 白藜芦醇与TAOK1蛋白的体外结合模型 |
| 2.6 白藜芦醇与TAOK1蛋白在食管鳞癌中相结合 |
| 2.7 白藜芦醇抑制TAOK1激酶的体外活性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 研究白藜芦醇通过靶向TAOK1对食管鳞癌的抑制效应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 低浓度白藜芦醇对食管正常上皮细胞无细胞毒性 |
| 2.2 白藜芦醇抑制食管鳞癌细胞的体外增殖 |
| 2.3 白藜芦醇抑制食管鳞癌细胞克隆的形成 |
| 2.4 白藜芦醇促进食管鳞癌细胞的凋亡 |
| 2.5 白藜芦醇抑制shTAOK1细胞体外增殖的能力弱于Scramble细胞 |
| 2.6 白藜芦醇下调TAOK1相关p38 MAPK信号通路 |
| 2.7 白藜芦醇抑制食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)的生长 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 本章结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 AKT作为癌症潜在治疗靶点的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间学术交流、发表学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（10）衣壳修饰型溶瘤腺病毒设计及其治疗恶性胶质瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 恶性胶质瘤治疗研究进展 |
| 1.1.1 恶性胶质瘤的传统疗法 |
| 1.1.2 恶性胶质瘤的生物治疗 |
| 1.1.3 溶瘤病毒治疗恶性胶质瘤进展 |
| 1.2 溶瘤腺病毒 |
| 1.2.1 腺病毒简介 |
| 1.2.2 溶瘤腺病毒条件复制策略 |
| 1.2.3 溶瘤腺病毒衣壳基因工程修饰策略 |
| 1.2.4 腺病毒脑靶向策略分析 |
| 1.3 TRAIL在恶性胶质瘤治疗中的应用 |
| 1.3.1 TRAIL结构、功能及信号通路 |
| 1.3.2 TRAIL治疗肿瘤的应用形式 |
| 1.3.3 TRAIL武装溶瘤腺病毒治疗恶性胶质瘤 |
| 1.4 立题依据及设计方案 |
| 1.4.1 立题依据及课题设计 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌种和动物 |
| 2.1.2 主要试剂及抗体 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受体表达分析 |
| 2.2.2 质粒构建 |
| 2.2.3 Ovelapping PCR |
| 2.2.4 腺病毒包装 |
| 2.2.5 腺病毒筛选 |
| 2.2.6 腺病毒纯化 |
| 2.2.7 OD260 法测定腺病毒滴度 |
| 2.2.8 病毒感染性质分析 |
| 2.2.9 Knob蛋白阻断感染实验 |
| 2.2.10 病毒感染的结合及内在化过程分析 |
| 2.2.11 细胞活力检测 |
| 2.2.12 Balb/c小鼠中病毒组织分布分析 |
| 2.2.13 溶瘤腺病毒体外血脑屏障穿透能力分析 |
| 2.2.14 溶瘤病毒体内靶向性分析 |
| 2.2.15 Annexin V表达分析 |
| 2.2.16 Dot blot |
| 2.2.17 体内评价溶瘤腺病毒治疗效果 |
| 2.2.18 免疫组织化学染色 |
| 2.2.19 数据统计分析 |
| 第3章 实验结果与讨论 |
| 3.1 Ad37-knob替换型溶瘤腺病毒的构建与评价 |
| 3.1.1 胶质瘤细胞α2→3-SA表达分析 |
| 3.1.2 Ad37-knob替换型溶瘤腺病毒载体骨架质粒的构建 |
| 3.1.3 Ad37-knob替换型溶瘤腺病毒载体的包装、筛选与鉴定 |
| 3.1.4 病毒感染性质体外分析 |
| 3.1.5 体外溶瘤性质评价 |
| 3.1.6 体内溶瘤能力分析 |
| 3.1.7 CRAd5/K37 体外血脑屏障模型穿透能力评价 |
| 3.1.8 CRAd5/K37 体内血脑屏障穿透能力分析 |
| 3.1.9 CRAd5/K37 病毒组织分布 |
| 3.1.10 小结 |
| 3.2 靶向肽修饰型CRAd5/K37 载体的设计与尝试 |
| 3.2.1 双级靶向肽修饰型CRAd5/K37 的设计 |
| 3.2.2 靶向肽修饰型Ad37-knob的原核表达及其对细胞结合能力分析 |
| 3.2.3 CRAd5/K37-peptide病毒骨架质粒的构建及病毒包装 |
| 3.2.4 靶向肽插入对fiber表达的影响 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 双修饰型溶瘤腺病毒载体的构建与评价 |
| 3.3.1 TRAIL作为靶向头基及治疗基因应用于恶性胶质瘤治疗的可行性分析 |
| 3.3.2 双修饰溶瘤腺病毒载体的包装、筛选及基因组鉴定 |
| 3.3.3 溶瘤腺病毒衣壳性质鉴定 |
| 3.3.4 病毒感染性质鉴定 |
| 3.3.5 双修饰溶瘤病毒跨血脑屏障能力分析 |
| 3.3.6 双修饰溶瘤腺病毒体外抑瘤能力评价 |
| 3.3.7 双修饰溶瘤腺病毒体内抑瘤效果评价 |
| 3.3.8 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、基因治疗中基因导入的三种非病毒感染方法（论文参考文献）
- [1]肿瘤常见突变在肿瘤响应免疫治疗中的作用和机制研究[D]. 龙敏. 浙江大学, 2021(01)
- [2]腺病毒介导白介素17A为靶点的抗体基因治疗抑制肝癌生长[D]. 邹昊玉. 华东师范大学, 2020(05)
- [3]HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究[D]. 沈阳坤. 福建师范大学, 2020(12)
- [4]绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究[D]. 杨惠. 内蒙古农业大学, 2020
- [5]miR-100靶向调控mTOR基因抑制套细胞淋巴瘤生长[D]. 林璐慧. 福建医科大学, 2020(02)
- [6]纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞[D]. 岳冉. 新乡医学院, 2020(12)
- [7]基于GPI锚定双功能HIV进入抑制剂的基因治疗策略[D]. 靳红亮. 北京协和医学院, 2020(05)
- [8]IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究[D]. 樊少臣. 南通大学, 2020
- [9]蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌生长中的作用及其抑制剂的筛选[D]. 宋孟秋. 郑州大学, 2020(02)
- [10]衣壳修饰型溶瘤腺病毒设计及其治疗恶性胶质瘤的研究[D]. 王立正. 吉林大学, 2019(02)