一、粘着斑激酶及其在肿瘤侵袭和转移中的作用（论文文献综述）
王贺雷[1]（2021）在《磷酸甘油酸变位酶-1（PGAM1）参与调控胃癌淋巴结转移的分子机制研究》文中研究表明目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,疾病进展快,恶性程度高,其发病率位居全球癌症发病率的第5位,而其死亡率达到了第3位。胃癌发病缺乏早期临床表现,确诊时往往处于TNM分期的III期或者IV期,而且这些病人中大多数伴有区域性淋巴结转移。手术是目前治疗胃癌的主要治疗方法,还有放疗、化疗等治疗方法,但晚期胃癌患者的整体预后仍然较差。临床研究表明,肿瘤细胞的侵袭和迁移是胃癌高死亡率的关键原因,但胃癌侵袭和转移的分子基础仍不清楚。因此,探索胃癌转移的机制,找到有效地预测胃癌淋巴结转移的分子标志物,以提高胃癌诊断水平和开发更有效的生物靶向药物是当务之急。我们实验的目的是筛选出参与胃癌淋巴结转移机制的关键基因,明确其对胃癌细胞侵袭转移的影响及具体作用机制,为中晚期胃癌的治疗提供新的治疗靶点,从而帮助改善胃癌病人的预后。研究方法:本研究以人胃癌原位组织（Cancer in situ,CIS）和淋巴结转移组织（Lymph node metastasis,LNM）为标本,通过显微切割技术和高通量RNA测序技术,检测3例胃癌合并淋巴结转移病人的CIS组织和LNM组织的mRNA表达谱,筛选出差异表达的一些基因,利用q-PCR的方法验证差异基因,从中选定在LNM组织中明显上调的磷酸甘油酸变位酶-1（PGAM1）,做进一步深入研究,明确其对胃癌细胞侵袭转移的影响及具体作用机制。在接下来的研究中,我们在56例临床样本中,利用免疫组化的方法验证PGAM1在CIS组织、癌旁组织及LNM组织中的表达差异,同时验证PGAM1在患者预后情况中的表达差异。在细胞水平,通过慢病毒载体构建稳定敲低PGAM1的胃癌细胞系SGC7901和BGC823,并通过Western-blot的方法验证敲低效率。成功敲低PGAM1后,利用CCK-8检测SGC7901和BGC823细胞增殖的变化;通过流式细胞仪检测SGC7901和BGC823细胞周期和早期凋亡的变化;通过划痕实验和Transwell检测SGC7901和BGC823细胞迁移和侵袭的变化。接着,我们建立了小鼠皮下荷瘤模型,进一步检测两种PGAM1基因敲低的胃癌细胞系的成瘤情况。最后,为了进一步研究PGAM1调控胃癌淋巴结转的具体机制,利用Western Blot的方法明确了参与PGAM1相关转移过程的潜在关键信号蛋白,以及PGAM1与Src/FAK/Paxillin信号转导通路的调控关系。结果:在本研究中,高通量RNA测序结果显示,与胃癌患者的CIS组织相比,PGAM1在LNM组织中显着高表达,且与患者预后不良相关。同样,定量PCR实验和免疫组化实验的结果证实了胃癌患者淋巴结转移中PGAM1呈高表达。为了阐明PGAM1在胃癌转移中的作用,我们在转移性胃癌细胞株SGC7901和非转移性胃癌细胞株BGC823中敲低PGAM1后,发现PGAM1敲低使细胞增殖受到损害,细胞周期出现停滞。此外,PGAM1敲低抑制胃癌细胞系的迁移,这与降低表达金属蛋白酶MMP2,MMP9和粘附分子ICAM-1有关。在小鼠异种移植模型中,PGAM1敲低的胃癌细胞在体内生长能力下降。Western Blot分析结果表明,相对于亲本细胞系,SGC7901和BGC823中PGAM1的敲低降低了Src、FAK和Paxillin的磷酸化。这些结果表明PGAM1可能通过Src/FAK/Paxillin信号转导通路驱动细胞增殖、激活细胞骨架重组和细胞迁移,从而在促进胃癌淋巴结转移中发挥重要作用。结论:1.PGAM1与胃癌预后相关:在伴有淋巴结转移的胃癌患者中,PGAM1在LNM组织中的表达要明显高于CIS组织。PGAM1在LNM组织中的高表达是胃癌预后不良的独立危险因素;2.PGAM1与胃癌细胞的增殖密切相关:敲低PGAM1后,胃癌细胞增殖速度减慢,细胞发生G1阻滞;3.PGAM1能调控胃癌细胞侵袭和转移:敲低PGAM1后,胃癌细胞的迁移速率降低,金属蛋白酶MMP2、MMP9以及粘附分子ICAM-1的表达降低,Src/FAK/Paxillin信号转导抑制,表明PGAM1能够通过调控胃癌细胞侵袭和转移密切相关蛋白的表达及相关通路活化,促进胃癌细胞的侵袭和转移。
陈奕雯[2]（2021）在《ROCK1/moesin激活TMEM16A钙激活氯通道促进乳腺癌迁移侵袭的机制研究》文中提出第一部分ROCK1通过磷酸化moesin促进乳腺癌细胞中TMEM16A通道活性目的:探讨Rho A/ROCK通路是否参与调节乳腺癌细胞TMEM16A通道活性。方法:应用全细胞膜片钳技术记录给予ROCK1抑制剂Y-27632前后T47D细胞在1μM内钙激活的TMEM16A氯电流。采用Western blot法检测转染Rho A活性突变体V14和无活性突变体19N质粒的T47D细胞中p-ROCK、ROCK、pmoesin和moesin的蛋白表达情况。全细胞膜片钳技术记录转染Rho A活性突变体V14/无活性突变体19N质粒以及moesin持续磷酸化T558D突变体/抑制磷酸化T558A突变体质粒的T47D细胞在1μM内钙激活的TMEM16A氯电流。并在转染TMEM16A过表达质粒的人胚肾HEK293细胞中验证moesin磷酸化对TMEM16A通道活性的影响。结果:给予ROCK1抑制剂Y-27632显着抑制了乳腺癌T47D细胞中TMEM16A钙激活氯电流。Western-Blot结果显示,转染Rho A活性突变体V14质粒导致p-ROCK1和p-moesin蛋白量表达增加。与转染Rho A-V14突变体过表达质粒相比,转染Rho A-19N突变体质粒的T47D细胞中钙激活氯电流显着减少。提示在乳腺癌细胞中Rho A的激活可以活化ROCK1和磷酸化moesin,进而促进TMEM16A通道活性。与转染抑制moesin磷酸化的T558A突变体的T47D细胞相比,转染moesin持续磷酸化T558D突变体质粒的T47D和HEK293细胞上TMEM16A钙激活氯电流显着增加。表明ROCK1是通过moesin T558位点的磷酸化促进了TMEM16A通道的活性。结论:ROCK1促进乳腺癌细胞中TMEM16A通道活性,Rho A/ROCK1信号通路是通过moesin 558位苏氨酸磷酸化而增强TMEM16A钙激活氯电流。第二部分Moesin参与调控TMEM16A钙激活氯通道促进乳腺癌细胞侵袭转移目的:Moesin促进乳腺癌侵袭转移的机制研究。方法:应用TCGA数据库分析乳腺癌患者中TMEM16A和moesin的ROC曲线,生存曲线及两者相关性。应用划痕实验、transwell实验检测在共转染高表达TMEM16A和moesin scramble对照质粒/moesin-sh RNA敲低质粒后,乳腺癌MCF-7细胞的侵袭迁移情况。分析不同moesin表达情况对过表达TMEM16A促进的乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响。应用细胞划痕实验、transwell实验检测转染moesin持续磷酸化突变体（moesin-T558D）、抑制磷酸化突变体（moesin-T558A）质粒后,乳腺癌MCF-7细胞的侵袭迁移情况。分析moesin磷酸化对乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响。在另一株乳腺癌细胞T47D上采用划痕实验、transwell细胞侵袭迁移实验验证上述结果。结果:TCGA数据库分析显示在未经药物治疗的乳腺癌患者中,TMEM16A和moesin联合表达与乳腺癌不良预后相关。细胞划痕和transwell侵袭迁移实验结果显示,过表达TMEM16A促进乳腺癌细胞MCF-7和T47D的侵袭迁移,敲低moesin之后与对照组（moesin scramble）相比抑制了TMEM16A促进的乳腺癌细胞侵袭迁移情况。证明TMEM16A通过moesin促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移。与空质粒对照组相比,moesin-T558D组促进了乳腺癌细胞的侵袭迁移,moesin-T558A组与moesin-T558D组相比抑制了乳腺癌细胞侵袭迁移。证明moesin可以通过对T558位点的磷酸化介导乳腺癌细胞的侵袭和迁移。结论:TCGA数据库分析显示TMEM16A和moesin联合表达与乳腺癌不良预后相关。TMEM16A高表达所促进的乳腺癌细胞侵袭迁移可被moesin敲低所抑制,moesin通过558位苏氨酸磷酸化介导乳腺癌细胞侵袭迁移。
江涛[3]（2020）在《ALOX12B在宫颈癌肿瘤进展中的作用和机制研究》文中研究表明目的:宫颈癌是一种恶性疾病,对全世界妇女的健康是一个巨大的威胁。手术切除及同步放化疗是治疗宫颈癌的主要策略。部分晚期肿瘤患者无法从传统治疗中获益,导致临床疗效欠佳。ALOX12B是一个编码脂氧合酶的基因,在肺癌和乳腺癌中检测到ALOX12B突变。此外,ALOX12B对表皮样癌细胞的增殖具有促进作用。然而,其在宫颈癌中的作用目前未见报道,因此有必要研究ALOX12B在宫颈癌中的作用及相关机制。方法:为研究ALOX12B在宫颈癌进展中的功能,通过慢病毒载体降低宫颈癌细胞系Ca-Ski和C33A中ALOX12B的表达,并通过q-PCR检测病毒对ALOX12B的敲低效率。设计CCK-8和克隆形成实验验证ALOX12B敲低后对宫颈癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。PI实验检测ALOX12B敲低后对宫颈癌细胞周期的影响。Transwell和划痕愈合实验检测ALOX12B对肿瘤细胞的迁移和侵袭的影响。此外,设计异种移植瘤模型验证ALOX12B在体内对宫颈癌进展的影响。为进一步阐明ALOX12B在宫颈癌发展中的作用机制,通过文献调研以及数据库分析预测ALOX12B的靶点。Western blot检测ALOX12B能否促进PTGS2的表达。此外,挽救实验检测PTGS2是否能够调控ALOX12B对宫颈癌细胞增殖的促进作用。结果:CCK-8和克隆形成实验发现ALOX12B敲低后宫颈癌细胞增殖和克隆形成能力均受到显着抑制。PI检测显示ALOX12B敲低后宫颈癌细胞周期阻滞于G1期。在异种移植瘤模型中的结果显示ALOX12B敲低能够显着抑制宫颈癌肿瘤的生长。此外,体外Transwell和划痕愈合实验表明ALOX12B对肿瘤细胞的迁移和侵袭无明显影响,而在体内实验中,Western blot分析显示ALOX12B能够调控肿瘤EMT相关蛋白（Vimentin,N-cadherin和E-cadherin）的表达。我们推测,与体外实验不同,宫颈癌肿瘤组织中ALOX12B的功能可能与宫颈癌肿瘤组织的低氧环境相关。通过文献调研以及数据库分析预测PTGS2可能是ALOX12B的主要靶点之一。Western blot检测显示ALOX12B能够显着促进PTGS2的表达。此外,挽救实验表明PTGS2能够调控ALOX12B对宫颈癌细胞增殖的促进作用。结论:综上所述,我们的研究报道了ALOX12B在宫颈癌肿瘤进展中的作用,且ALOX12B可能通过PTGS2调控宫颈癌进展。本研究为探索宫颈癌患者新的治疗方法提供理论指导。
闫欢[4]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中研究说明研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
常渊[5]（2020）在《COX-2、PD-L1和ANXA2在腮腺良恶性肿瘤的表达》文中研究表明目的通过研究环氧合酶2（COX-2）、程序性死亡分子配体-1（PD-L1）、膜联蛋白A2（ANXA2）在腮腺良恶性肿瘤中的特异性表达及其表达强度,结合其在不同临床病理学分级的恶性肿瘤中的梯度表达变化及其相关程度,可以辅助判断肿瘤的恶性或为术后评估提供较为可靠的病理学依据,为腮腺良恶性肿瘤的鉴别诊断及腮腺恶性肿瘤的临床预估和治疗思路提供有意义的病理学参考。方法收集2014年9月1日到2019年9月2日这五年期间在华北理工大学附属医院口腔科住院并经过手术治疗的,且由本院病理科确诊证实的腮腺恶性肿瘤组织标本存档蜡块50例,作为恶性标本实验组。再从同期组织标本存档中随机选取肿瘤组织和正常腺叶各50例,分别作为良性标本实验组和正常标本对照组。上述病理切片来源患者均为初次手术治疗,术前均未经任何手术治疗和放化疗或激素治疗,全身无其它肿瘤病史。在本院病案科和病理科收集以上患者完整的病历资料和病理信息。其中,腮腺恶性肿瘤依据2019年6月美国国立综合癌症网络修订的《Head and Neck Cancer》的标准进行病理学分类。利用免疫组化SP法分别检测COX-2、PD-L1及ANXA2在腮腺良恶性标本实验组和对照组中的表达及其表达强度。所得实验结果基于统计软件SPSS 21.0进行相关性和显着性检验。结果1在腮腺正常、良性腮腺肿瘤、恶性腮腺肿瘤组织,COX-2的阳性表达率分别为10.0%、42.0%、90.0%;PD-L1的阳性表达率分别为8.0%、46.0%、82.0%;ANXA2的阳性表达率分别为38.0%、58.0%、78.0%,分析可得COX-2、PD-L1和ANXA2在腮腺正常、腮腺良性、腮腺恶性肿瘤组织中的阳性表达率均呈递增趋势,统计验证有效（检验水准取P<0.05）。2（1）在腮腺恶性肿瘤组织中,COX-2在不同的T分类的四组中的阳性表达率分别为33.3%、92.9%、100.0%、100.0%,在四组间存在明显差异;在长期吸烟和非长期吸烟患者中的表达率分别为100.0%、77.3%,个人吸烟史不同的两组中表达具有显着差异（P<0.05）;但其表达与性别、肿瘤的淋巴结和组织转移无统计学意义（P>0.05）。（2）在腮腺恶性肿瘤组织中,PD-L1在T分类组织中的阳性表达率分别为33.3%、78.6%、90.5%、100.0%,不同T分类的四组,组间表达存在显着差异（P<0.05）;其表达率与肿瘤的淋巴结转移、远端转移、性别和吸烟史的差异结果无统计学意义（P>0.05）;（3）在腮腺恶性肿瘤组织中,ANXA2的阳性率在N分类组织中分别为62.5%、94.1%、88.9%,不同N分类的三组组间差异有统计学研究意义（P<0.05）;在长期吸烟和非长期吸烟患者中阳性率分别为92.8%、59.1%,个人吸烟史不同的两组中表达不同,结果有统计意义（P<0.05）。ANXA2的阳性表达差异与性别、肿瘤的大小和远端转移情况无统计学意义（P>0.05）。3在恶性腮腺肿瘤组织,COX-2与PD-L1的表达强度互为正向相关,r=0.468,相关程度具有统计学研究意义（P<0.05）;PD-L1与ANXA2的阳性表达率存在正相关的关系,r=0.364,关系具有统计学意义（P<0.05）;COX-2与ANXA2阳性表达率为正相关,r=0.505（P<0.05）,相关性具有统计意义。结论1 COX-2、PD-L1及ANXA2在腮腺正常组织、良性肿瘤和恶性肿瘤中的阳性表达均呈递增趋势。2 COX-2的阳性表达率与肿瘤的直径有关,而且长期吸烟患者肿瘤组织中表达率更高;PD-L1的阳性表达率在直径越大的恶性腮腺肿瘤组织中表达越强;ANXA2的阳性表达率与腮腺恶性肿瘤淋巴结转移和吸烟史有关。3在腮腺恶性肿瘤中,COX-2、PD-L1和ANXA2均互为正相关。图7幅;表7个;参45篇。
任莹慧[6]（2020）在《肿瘤相关成纤维细胞的自噬水平在其促进肺癌细胞转移中的作用机制研究》文中研究表明研究目的:肺癌是最常见、死亡率最高的恶性肿瘤。肿瘤转移是阻碍肺癌临床有效治疗的关键问题,因此深入探究肺癌转移机制并开发针对性的治疗策略刻不容缓。肿瘤微环境因其可以从多个方面参与肿瘤的发生发展过程,近些年受到广泛关注。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤微环境中最丰富的细胞成分之一,其能够通过直接接触或旁分泌的方式促进肿瘤的进展,因此成为实体肿瘤治疗的潜在靶点。细胞自噬是一种在进化上高度保守的细胞过程,其可以使细胞在面对营养物质缺乏等压力时通过批量降解细胞内容物得以存活。研究发现自噬过程在肿瘤发生、发展和治疗中至关重要。然而,CAFs的自噬水平以及其对肺癌细胞的增殖和侵袭转移的影响尚不清楚。因此,本研究从肺癌CAFs的自噬水平入手,利用自噬抑制和激活剂等材料和方法,系统探究CAFs的自噬水平在CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响中的作用,并进一步探究发挥作用的关键因子及作用机制。本研究可以加深对肺癌转移机制的理解,并为肺癌的治疗提供新策略。方法:一、体外研究1.CAFs的分离培养和自噬水平的检测:从肺癌临床标本中分离、培养、鉴定CAFs和正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）,通过Western blot、GFP-LC3斑点化实验以及吖啶橙染色等实验方法,检测NFs和CAFs的自噬水平。2.抑制CAFs的自噬对CAFs促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移作用的影响:运用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）、氯喹（chloroquine,CQ）干预CAFs,或者通过RNAi方法敲低CAFs中自噬基因ATG5的表达,收集干预后CAFs的条件培养基（CAF-conditioned medium,CAF-CM）,用此CAF-CM培养肺癌细胞。通过CCK-8实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验检测抑制自噬后CAFs对肺癌A549细胞和H661细胞增殖、侵袭和迁移的影响。同时通过定量PCR和Western blot检测肺癌细胞中转移相关基因（MMP2、Twist、MMP9）和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关标志物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的表达水平变化。3.激活CAFs的自噬对CAFs促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移作用的影响:运用自噬特异性激活剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）干预CAFs,收集干预后的CAF-CM,用此CAF-CM培养肺癌细胞。通过CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell小室实验以及Western blot检测激活自噬后,CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移作用的影响以及对肺癌细胞中转移和EMT相关基因蛋白表达水平的影响。4.CAFs的自噬水平对高迁移率族蛋白B1（high mobility group box protein 1,HMGB1）分泌的影响:Western blot检测NFs和CAFs中HMGB1的表达水平,通过ELISA检测肺癌细胞、NFs和CAFs等不同细胞的HMGB1分泌水平。运用3-MA、CQ、RAPA干预CAFs或者通过RNAi方法敲低CAFs中ATG5的表达,通过ELISA检测调控CAFs自噬水平后对CAFs分泌HMGB1的影响。5.HMGB1对CAFs自噬水平的影响:用HMGB1重组蛋白处理CAFs,通过GFP-LC3斑点化实验及Western blot检测用HMGB1干预后CAFs自噬水平的变化。6.CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响:用加入HMGB1中和抗体或HMGB1抑制剂的CAF-CM,或者用加入HMGB1重组蛋白的正常培养基培养肺癌细胞,通过CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell小室实验以及Western blot检测CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响。7.CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响:收集3-MA、CQ、RAPA或si ATG5干预CAFs后的CAF-CM培养肺癌细胞,Western blot检测调控CAFs自噬水平后CAFs对肺癌细胞中TLR4/NF-κB信号通路中关键信号分子TLR4、p-IκBα、IκBα和p-p65表达水平的影响,并结合HMGB1中和抗体及HMGB1重组蛋白评估CAFs分泌的HMGB1在肺癌细胞TLR4/NF-κB信号通路中的作用。二、体内研究裸鼠体内实验验证:将经CQ预处理的CAFs与A549混种于裸鼠背部皮下建立皮下瘤模型,同时设立未处理的CAFs为对照,饲养5周后剥离肿瘤组织,测量肿瘤组织的体积及重量,并通过Western blot检测肿瘤组织中TLR4/NF-κB信号通路中关键信号分子、转移相关基因、EMT相关标志物的表达水平。结果:1.肺癌CAFs的基础自噬水平高于NFs。2.降低CAFs的自噬水平可以减弱CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用,削弱CAFs对肺癌细胞中转移相关基因MMP2、Twist、MMP9和间质标记物N-cadherin、Vimentin表达的上调作用以及上皮标记物E-cadherin表达的下调作用。3.提高CAFs的自噬水平可以增强CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用,促进CAFs对肺癌细胞中转移相关基因和间质标记物表达的上调作用以及上皮标记物表达的下调作用。4.与NFs和肺癌细胞相比,CAFs能够分泌更多的HMGB1。调控CAFs的自噬水平可影响CAFs分泌HMGB1;并且HMGB1能够进一步上调CAFs的自噬水平,表明CAFs和HMGB1之间具有正反馈调节作用。5.CAFs分泌的HMGB1激活肺癌细胞中的TLR4/NF-κB信号通路,进而促进肺癌细胞的增殖和侵袭转移。6.体内研究显示,CAFs促进肺癌细胞的体内生长。抑制CAFs的自噬水平能够有效减弱CAFs对肺癌细胞EMT及TLR4/NF-κB信号通路的激活作用,进而减弱CAFs促进肺癌细胞体内生长的作用。结论:1.肺癌的CAFs具有较高的基础自噬水平。2.CAFs高水平的自噬介导了CAFs促进肺癌细胞增殖及侵袭转移的作用。3.CAFs的高自噬水平与CAFs分泌的HMGB1之间存在正反馈调控关系。4.CAFs通过分泌HMGB1,激活肺癌细胞中TLR4/NF-κB信号通路,促进肺癌细胞增殖及侵袭转移。5.抑制CAFs的自噬水平能够有效减弱CAFs促进肺癌细胞在体内的生长。
刘东明[7]（2020）在《细胞粘附分子SVEP1参与调控肝癌恶性进展的分子机制研究》文中认为研究背景和目的自20世纪以来,癌症已经成为威胁人类健康的主要疾病。国际癌症研究机构于2012年评估了世界范围内的27个主要癌症的发病率和死亡率,结果显示有1410万癌症新发病例和820万癌症相关死亡病例,这其中约有22%的新增癌症病例和27%的癌症死亡病例发生在中国。众所周知,恶性肿瘤的不良预后往往与其早期发生转移密切相关。转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征之一,也是临床上大多数肿瘤患者致死的最主要因素,约90%的癌症患者死于肿瘤的转移。可以说,转移是肿瘤临床治疗过程中面临的最为严峻的考验,也是目前肿瘤研究的热点之一。细胞间粘附能力的改变在肿瘤转移的过程中发挥重要作用,而细胞粘附分子（Cell adhesion molecules,CAMs）与肿瘤细胞粘附能力的改变密切相关,但其机制仍亟待阐明。本课题前期通过对不同复发转移特征的两组巴塞罗那分期（BCLC staging）为B期的肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）患者的肿瘤组织进行全转录组测序后发现,两组患者的差异表达基因显着富集在粘附相关通路,进一步通过Heatmap分析,对富集在粘附通路中的差异表达基因进行提取和比对后发现,SVEP1作为一种CAMs分子在术后高复发组HCC中的表达显着低于低复发组,结合国内外相关报道及前期研究结果,推测SVEP1可能是参与介导肝癌复发转移的关键分子。因此,本课题拟通过免疫组化、生物信息学分析、免疫印迹、RT-PCR、体外细胞功能实验、双荧光素酶报告实验、全转录组测序分析、恢复实验和体内动物实验等研究手段明确SVEP1与HCC复发转移间的关系以及探究SVEP1参与调控HCC转移的分子机制。研究方法1.应用207例肝癌组织芯片和4对肝癌冰冻组织样本,借助免疫组化、单因素Kplan-Meier法、多因素Cox法、Spearman相关性分析、亚组分析和免疫印迹实验初步探究SVEP1在肝癌中的表达情况及其对肝癌患者预后的影响。2.基于TCGA及GEO数据库,使用生物信息学分析（差异表达分析、生存分析和GSEA分析）进一步验证免疫组化及免疫印迹实验得到的结论。3.使用免疫印迹法检测不同肝癌细胞株中SVEP1的表达水平差异,应用慢病毒感染法构建SVEP1稳定降表达组和相应对照组的肝癌细胞系。4.应用SVEP1稳定降表达的肝癌细胞系及其对照细胞系,进行细胞增殖相关实验（CCK-8实验）和细胞侵袭迁移相关实验（趋化实验、侵袭实验、运动实验及划痕实验）,探究SVEP1的不同表达水平对肝癌细胞增殖和侵袭迁移能力的影响。5.重新比对不同复发风险的BCLC-B期肝癌患者的转录组测序结果并结合miRWalk、RNA22、miRanda、Targetscan、mirbase等五种公共数据库,寻找可以潜在调控SVEP1的microRNA。6.应用TCGA公共数据库对相关microRNA进行差异表达分析及生存分析验证。7.应用双荧光素酶报告实验进一步验证相关microRNA对SVEP1的直接调控作用,在肝癌细胞系中转染miRNA mimics/inhibitors以及相应对照并验证,同时检测其中SVEP1的表达水平,应用功能实验验证microRNA的不同表达水平对肝癌细胞功能的影响。8.将前期成功构建的SVEP1降表达肝癌细胞系及对照组细胞系进行全转录组测序分析,寻找差异基因及相关富集通路,应用免疫印迹、细胞功能实验和恢复实验进一步探索SVEP1调控肝癌进展的下游分子网络。9.构建SVEP1降表达及对照组细胞系的小鼠肝癌移植瘤模型,在体内观察SVEP1的不同表达水平对肝癌细胞增殖和侵袭转移的影响,同时验证相关信号通路中重要分子表达水平的改变。研究结果1.通过不同复发风险的BCLC-B期肝癌患者的全转录组测序分析发现,差异基因显着富集在粘附通路,其中SVEP1在高复发风险肝癌患者中显着低表达;TCGA、GEO及GSEA分析证实SVEP1在HCC组织中低表达,且低表达与不良预后相关。2.通过免疫印迹及免疫组化实验发现,SVEP1在HCC癌旁组织中的表达水平显着高于其相应癌组织中的表达水平,并且低表达SVEP1是影响HCC总生存期（overall survival,OS）和无复发生存期（disease-free survival,DFS）的独立危险因素;通过Spearman法分析了SVEP1的表达水平与临床病理学因素间的相关性,发现SVEP1的表达水平与肝癌的肿瘤大小（定义3cm为肿瘤大小的临界值）和微卫星病灶的发生率显着负相关;此外,在肿瘤直径≥3cm和伴有微卫星结节的肝癌高危亚组患者中,SVEP1的高表达是影响肝癌预后的重要保护因素。3.SVEP1在肝癌细胞系Hep3B和MHCCLM3中表达水平较高,构建并验证SVEP1-SCR/KD的肝癌细胞系。4.CCK-8实验证实降表达SVEP1的肝癌细胞系增殖能力较对照组更强;划痕实验、趋化实验、侵袭实验及高内涵显微镜运动实验证实降表达SVEP1的肝癌细胞系侵袭迁移能力较对照组更强。5.基于全转录组测序数据及Targetscan等公共数据库,发现miR-1269b可以潜在调控SVEP1的转录水平。6.TCGA数据库分析表明miR-1269b在肝癌中的表达水平显着高于其相应的癌旁组织,高表达miR-1269b的肝癌患者预后不佳。7.双荧光素酶报告实验证实miR-1269b可以直接调控SVEP1的转录水平,利用RT-PCR、免疫印迹及划痕实验证实,抑制miR-1269b表达可促进SVEP1表达水平的升高,进而介导了肝癌细胞运动能力减弱;而促进miR-1269b表达则可抑制SVEP1的表达,从而介导了肝癌细胞运动能力的增强。8.通过对Hep3B-SCR及KD细胞系的全转录组测序分析发现,差异表达基因主要富集在PI3K/Akt信号通路中,Heatmap分析结果证实降表达SVEP1可以介导PI3K/Akt信号通路中FGF9、THBS1、NFKB1、CCNE2等重要基因表达水平的上调,应用RT-PCR实验在Hep3B-SCR/KD细胞系中二次验证以上结论。9.Hep3B-SCR/KD以及Hep3B-KD+LY294002（PI3K/Akt信号通路抑制剂）细胞株中p-Akt308的表达水平发生了改变,而总AKT和p-Akt473的表达水平不变;与Hep3B-KD细胞系相比,Hep3B-KD+LY294002细胞的增殖和侵袭能力下降。10.动物实验结果表明,与对照组细胞形成的移植瘤模型相比,SVEP1-KD组移植瘤模型的瘤体积更大且容易发生肺转移,同时p-Akt308和PKCζ的表达水平更高。研究结论SVEP1作为细胞与细胞间粘附的重要CAMs分子,在调控细胞及组织稳态的过程中发挥着重要的作用。目前,尚没有任何数据阐释SVEP1在恶性肿瘤进展及转移过程中的具体调控机制。本课题前期经过对不同复发转移风险的两组BCLC分期为B期的肝癌患者组织样本进行全转录组测序分析,筛选出了富集在粘附通路中的差异表达基因SVEP1,进一步通过大样本免疫组化染色分析结合TCGA/GEO数据库分析,初步明确了SVEP1低表达可作为预测肝癌预后的独立危险因素,低表达SVEP1与肿瘤的大小和转移密切相关;通过一系列细胞功能实验证实降表达SVEP1可以促进肝癌细胞的增殖和侵袭转移;通过全转录组测序、公共数据库分析发现miR-1269b可以调控SVEP1的转录水平,进一步的分子生物学实验证实SVEP1是miR-1269b的直接靶基因。SVEP1通过PI3K/Akt信号通路调控肝癌的恶性表型转化,通过移植瘤模型证实低表达SVEP1促进肝癌的进展。本课题结合生物样本大数据库分析、分子生物学实验、细胞生物学实验及移植瘤模型等多种方法证实了SVEP1在肝癌恶性表型转化过程中的作用及分子机制,阐明了miR-1269b-SVEP1-PI3K/Akt生物学轴在肝癌增殖和侵袭转移中的作用,对丰富临床治疗手段或治疗靶点有着至关重要的作用。
白一涵[8]（2020）在《新型脂肪因子CTRP6促进卵巢癌网膜转移的机制研究》文中提出目的:在卵巢癌网膜转移动物模型RNAseq测序结果基础上,筛选出在卵巢癌网膜转移过程中强势表达的基因——补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6（Complement C1q Tumor Necrosis Factor-Related Protein 6 CTRP6）;在体外细胞水平进一步探究CTRP6通过调节网膜脂肪细胞脂代谢促进卵巢癌网膜转移的机制研究。方法:利用GO富集分析卵巢癌网膜多时点动态测序结果,筛选出在卵巢癌网膜转移形成差异表达基因;利用GEO数据集（GES30587）和Kaplan Meier Plotter网站分析差异表达基因CTRP6在卵巢癌原发灶和转移灶之间的表达差异及其与卵巢癌患者预后的关系;利用慢病毒感染构建稳定过表达和沉默CTRP6的卵巢癌细胞株,前脂肪细胞原代培养,通过细胞共培养体系,利用细胞增殖实验检测卵巢癌细胞生长能力变化,利用粘附实验检测卵巢癌细胞对脂肪细胞的粘附能力,利用transwell检测卵巢癌细胞迁移改变;利用游离脂肪酸检测试剂盒检测共培养体系中脂肪细胞游离脂肪酸的释放情况,运用Western blot实验验证CTRP6对脂代谢酶激素敏感性脂肪酶（hornone-sensitive lipse,HSL）磷酸化改变和AMPK通路激活。结果:（1）通过D0、D1、D3、D10和D21多时间点动态测序发现,D3是转移形成前后的窗口期,CTRP6在D3强势表达,并且持续增高;（2）GO富集分析发现卵巢癌网膜转移形成过程中的动态改变主要发生在细胞间粘附,免疫调控,炎症反应以及代谢;（3）GEO数据集分析发现CTRP6在卵巢癌转移灶中表达水平高于原发灶并且高表达CTRP6与卵巢癌患者的不良预后有关（P<0.05）;（4）体外细胞实验证实过表达或敲低CTRP6对卵巢癌细胞的生长和迁移能力无影响,在共培养体系中,过表达CTRP6能促进卵巢癌细胞的生长、粘附和迁移（P<0.05）,反之亦然;游离脂肪酸试剂盒检测到在与过表达CTRP6的卵巢癌细胞共培养后脂肪细胞游离脂肪酸的释放增加,并且促进AMPK蛋白磷酸化水平的增加,进而激活脂肪细胞相关代谢酶脂肪三油甘酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase,ATGL）和激素敏感性脂肪（hornone-sensitive lipse,HSL）。结论:（1）生信分析提示CTRP6在小鼠卵巢癌腹腔转移模型中对促进卵巢癌网膜转移发挥着重要作用;（2）临床数据分析发现CTRP6在卵巢癌转移灶的表达高于原发灶且与卵巢癌患者的不良预后相关;（3）CTRP6通过激活AMPK在TH172位点的磷酸化,促进脂肪细胞相关脂代谢酶ATGL m RNA表达增加和HSL磷酸化水平的增加,促进了脂肪细胞游离脂肪酸释放的增加,从而参与促进卵巢癌细胞的生长、粘附和迁移。
谭琪[9]（2020）在《Slit2-Robo1信号通过活化Src诱导E-cadherin磷酸化及上皮-间质转化的研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的结直肠癌是全世界最常见的癌症之一,晚期转移患者的疗效仍不理想,存活率较低。研究显示,上皮-间质转化（EMT）是癌症转移的早期步骤,而细胞间重要的粘附分子E-cadherin降低是EMT的关键环节。调节E-cadherin的因素众多,前期研究显示:Slit2-Robo1能使E-cadherin磷酸化,然后经Hakai泛素化、降解,从而诱导EMT。但Slit2-Robol诱导E-cadherin磷酸化降解的具体机制尚不清楚。本研究的目的是探索Slit2-Robo1诱导结直肠癌细胞E-cadherin磷酸化降解的具体机制,为抑制肿瘤转移提供新靶点。研究方法1.构建 HCT116/V、HCT116/Robo1 和 HCT116/Robo1/Slit2 稳定过表达细胞株,用免疫沉淀和Western-blot方法检测Slit2-Robo1对Src活性以及E-cadherin磷酸化的影响。敲除HCT116/Robo1/Slit2细胞中的Src,观察E-cadherin的磷酸化和降解有无变化。2.用免疫共沉淀的方法检测三种细胞株中Robo1、Src和E-cadherin的结合情况。用全长或各种缺失突变的E-cadherin质粒和全长Robo1质粒共转染HEK293细胞,用免疫共沉淀的方法检测Robo1与E-cadherin的结合位点。然后,构建重组纯化蛋白His-CC3（Robo1胞内区C末端区段）、GST-Src、GST-E-cadherin 和 GST-N-cadherin,检测 Robo1 与 Src、E-cadherin 是否直接结合及是否介导E-cadherin与Src结合,检测N-cadherin能否与Robo1结合,以及Src和Robo1的结合位点。3.构建含有Robo1胞内区CC3段的质粒,转染HCT116/Robo1/Slit2细胞,观察Robo1、Src和E-cadherin之间的相互作用,检测Src的活性以及E-cadherin的磷酸化、泛素化和降解,通过细胞免疫荧光染色观察细胞形态并检测其迁移能力。研究结果1.hSlit2能激活HCT116/Robo1细胞中的Src,诱导E-cadherin磷酸化;但经R5（Slit2-Robo1结合阻断抗体）处理后,hSlit2的作用消失。敲除HCT116/Robo1/Slit2 细胞中的 c-Src 之后,hSlit2 无法磷酸化 E-cadherin,E-cadherin降解被抑制。2.只有 HCT116/Robo1/Slit2 细胞中能检测到 Robo1 与 E-cadherin、Src 结合（该作用可被R5抑制）,而HCT116/V和HCT116/Robo1细胞中未发现;HCT116/V细胞中Src不与E-cadherin结合。HEK293细胞转染实验发现Robo1的CC3段与E-cadherin胞内段结合。重组蛋白实验结果显示Robo1的CC3段能与E-cadherin直接结合,而不与N-cadherin结合;Src的SH2/SH3能与CC3段直接结合,而单独的SH2或SH3与CC3段结合较弱。3.Robo1 CC3段过表达的HCT116/Robo1/Slit2细胞中,与Robol结合的E-cadherin和Src明显减少,Src活性降低;E-cadherin的表达水平升高,泛素化减弱,降解减少。细胞免疫荧光染色观察到细胞从梭形、多边形变成了类圆形。结论1.Slit2与Robo1结合诱导Robo1胞内区与Src结合,活化Src激酶,促进E-cadherin与Src激酶结合,诱导E-cadherin磷酸化、泛素化及降解。2.Slit2诱导Robo1与胞浆内的E-cadherin、Src形成三聚体,Robo1的CC3段分别与E-cadherin胞内区和Src的SH2/SH3区直接结合,充当连接蛋白介导E-cadherin 与 Src 的结合。3.Robo1的CC3段可作为竞争分子,竞争性抑制Robo1-Src-E-cadherin三聚体形成,从而降低Src的活性,抑制E-cadherin磷酸化和泛素化,阻止E-cadherin降解,从而抑制EMT,可作为肿瘤治疗备选靶点。
臧丹[10]（2020）在《Exosomal UBE3B及LPPR4促进胃癌腹膜转移的机制研究》文中研究说明目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内具有很高的发病率和死亡率。腹膜转移是晚期胃癌患者发生转移的主要途径,通常会导致大量的腹水或肠梗阻。然而,目前针对于胃癌的腹膜转移,尚未发现具有可靠的诊断和预测预后价值的生物标志物,究其原因,还是对胃癌腹膜转移的机制仍有不明之处。本研究旨在探讨胃癌腹膜转移的机制,并对该过程的关键分子的作用进行深入探讨。研究方法:1.超速离心法提取外泌体。2.电镜和NanoSight鉴定外泌体。3.DID标记外泌体。4.蛋白免疫印迹（Western blotting）方法检测蛋白表达。5.Transwell伤口愈合实验检测细胞迁移侵袭能力。6.肿瘤细胞与腹膜间皮细胞粘附实验检测细胞的粘附能力。7.免疫荧光和免疫组化检测腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelial cells,PMCs）和癌相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）相关分子的表达。8.采用裸鼠腹膜种植模型进行体内研究。9.小动物PET检测裸鼠腹膜转移结节代谢水平。10.全转录组测序筛选差异表达基因。11.运用生物信息学方法筛选差异表达基因。12.Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验分析LPPR4高低表达组患者的总生存时间的差异。13.应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）评估LPPR4对胃癌腹膜转移诊断的敏感性和特异性。14.应用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测mRNA表达。15.采用si RNA或cDNA质粒转染技术对目的基因进行瞬时沉默或过表达。16.采用慢病毒转染技术建立稳转细胞系,沉默或过表达目的基因。17.京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics,KEGG）和基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）探讨LPPR4相关信号通路。18.免疫共沉淀方法检测蛋白与蛋白的直接结合能力。19.Spearman相关分析来分析基因之间的相关性。20.统计学分析:采用GraphPad Prism,Social Sciences（SPSS）20.0版和R软件进行统计相关分析。实验数据显示为三次独立重复实验的平均值±标准差（SD）。使用Student’s t检验评估两组数据之间的差异。P<0.05认为具有统计学意义。结果:1.腹膜PMN的形成促进胃癌腹膜转移。通过对胃癌腹膜转移患者腹膜组织进行免疫组化染色结果显示,CAFs相关分子α-SMA显着高表达,而PMCs相关分子Calretinin和WT1则呈现低表达。2.腹膜高转移胃癌细胞系MKN45 P的建立及验证。通过光学显微镜下观察细胞形态变化结果显示MKN45 P细胞相比MKN45细胞形态明显梭形改变。Transwell实验结果表明MKN45 P细胞相比MKN45细胞迁移能力明显增强。通过裸鼠体内实验结果表明MKN45 P较MKN45细胞更能促进裸鼠腹腔转移瘤的形成。3.癌细胞来源exosomes的提取和内化的验证。通过在电镜下观察exosomes的形态发现exosomes呈典型的杯状形态。Nanosight方法检测exosomes的粒子直径结果提示exosomes的直径峰值为96.5 nm。Western blotting方法检测exosomes的特征性标志物结果显示Flotillin-1,CD63,TSG101,CD9在exosomes中的表达均明显高于细胞中的表达。内化实验结果表明DID标记的exosomes被受体细胞HMrSV5细胞有效摄取。4.MKN45 P来源的exosomes促进PMCs的迁移。Transwell实验结果显示相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞的迁移能力明显增强,且呈现递增趋势。5.MKN45 P来源的exosomes促进胃癌细胞粘附于PMCs。肿瘤细胞-腹膜间皮细胞粘附实验结果显示相比于PBS对照组,与MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞粘附的胃癌细胞数量显着增多,且呈现递增趋势。6.MKN45 P来源的exosomes促进PMCs向CAFs转化。通过在光学显微镜下观察HMrSV5细胞的形态改变结果显示相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞形态发生明显的梭形改变。Western blotting和免疫荧光检测PMCs向CAFs转化过程相关指标结果表明相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes处理后,HMrSV5细胞α-SMA和波形蛋白（Vimentin）明显上调,而WT1和紧密连接蛋白（Zo-1）明显下调。7.MKN45 P分泌的exosomes促进裸鼠腹膜转移瘤形成。通过在裸鼠腹腔内注射MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes或等体积的PBS作为对照进行预处理,然后腹腔注射胃癌细胞MKN45进行裸鼠体内实验。通过小动物PET结果显示相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞来源的exosomes预处理后能明显增强腹膜转移瘤的代谢水平。解剖裸鼠后观察到MKN45 P分泌的exosomes更能促进裸鼠腹膜转移瘤形成。8.MKN45 P来源的exosomes促进裸鼠PMCs向CAFs转化。通过取裸鼠腹膜组织进行HE染色观察到PBS对照组腹膜主要由单层连续的腹膜间皮细胞构成,而MKN45和MKN45 P exosomes预处理组的裸鼠腹膜发生明显增厚,呈显着的纤维化改变。通过免疫组化和免疫荧光染色结果提示相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes预处理组的裸鼠腹膜组织中PMCs相关分子Calretinin和Mesothelin的表达水平显着下调,而CAFs相关分子α-SMA的表达水平显着上调。9.Exosomal UBE3B是参与腹膜特异性PMN形成的关键性分子。通过将MKN45和MKN45 P细胞进行全转录组测序,对差异表达基因进行KEGG通路富集分析结果发现泛素蛋白酶体通路是重要的差异通路。Western blotting验证实验发现UBE3B可能是其中的关键性分子。10.胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B过表达及内化的验证。采用慢病毒在MKN45细胞中过表达UBE3B。内化实验结果证实Exosomal UBE3B被HMrSV5细胞有效摄取,且UBE3B在过表达UBE3B的MKN45细胞来源的exosomes中也呈现过表达。11.胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B增强PMCs的迁移能力。Transwell实验结果显示相比于对照组,过表达UBE3B的MKN45细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞的迁移能力显着增强。12.胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B促进胃癌细胞粘附于PMCs。肿瘤细胞-腹膜间皮细胞粘附实验结果显示相比于对照组,过表达UBE3B的MKN45细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞粘附的胃癌细胞数量显着增多。13.胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B促进PMCs向CAFs转化。通过在光学显微镜下观察HMrSV5细胞的形态变化提示相比于对照组,过表达UBE3B的MKN45细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞发生了梭形改变。通过Western blotting和免疫荧光结果表明相比于对照组,过表达UBE3B的MKN45细胞分泌的exosomes处理后,HMrSV5细胞α-SMA和Vimentin明显上调,而WT1和Zo-1显着下调。14.生物信息学筛选胃癌不良预后和腹膜转移相关基因。在TCGA-STAD和GSE62254数据集中筛选出胃癌中既具有不良预后价值又与腹膜转移相关的差异表达基因,包括8个基因,LPPR4排名在第二位。15.LPPR4在胃癌腹膜转移患者中高表达并与胃癌患者不良预后相关。通过对GSE62254数据集分析结果提示胃癌腹膜复发组患者LPPR4的表达显着高于无腹膜复发组。通过对TCGA-STAD和GSE62254数据集进行生存分析结果提示LPPR4高表达的胃癌患者的总生存期显着低于LPPR4低表达的胃癌患者。16.LPPR4可作为预测胃癌腹膜转移的生物标志物。通过绘制ROC曲线结果显示LPPR4对胃癌腹膜转移的诊断具有很高的敏感性和特异性。17.LPPR4在胃癌细胞系中表达上调。qRT-PCR和Western blotting检测LPPR4表达水平结果显示相比于胃正常上皮细胞GES-1,LPPR4在胃癌细胞中表达显着上调。根据LPPR4表达水平,采用siRNA在LPPR4高表达的HGC27和MKN74细胞中进行基因沉默,采用过表达质粒在LPPR4低表达的MGC803细胞中进行基因过表达。18.LPPR4促进胃癌细胞迁移侵袭。Transwell和伤口愈合实验结果提示沉默LPPR4后胃癌细胞迁移侵袭能力减弱,反之过表达则增强。19.LPPR4促进胃癌细胞粘附于PMCs。胃癌细胞与PMCs的粘附实验结果表明沉默LPPR4后与PMCs粘附的胃癌细胞减少,反之过表达则增多。20.体内实验证实LPPR4促进胃癌腹膜转移。采用慢病毒在HGC27细胞中敲减LPPR4。通过裸鼠体内实验结果表明沉默LPPR4后裸鼠腹膜转移结节数量及重量明显减少。21.LPPR4与细胞粘附分子（Cell adhesion molecules,CAMs）通路相关。通过KEGG和GSEA富集分析结果发现LPPR4高表达与细胞粘附分子通路相关。22.LPPR4参与调节integrinα/FAK信号通路。Western blotting结果提示沉默LPPR4后显着下调了ITGA/FAK通路相关蛋白表达;反之过表达则上调。但是ITGB的表达无明显变化。Spearman相关性分析显示LPPR4与ITGA的表达均呈正相关。23.LPPR4通过Sp1转录因子调控integrinα的表达。免疫共沉淀实验结果显示LPPR4与ITGA之间不存在直接相互作用。通过UCSC基因组网站和JASPAR数据库发现Sp1是ITGA的潜在转录因子。Spearman相关性分析显示LPPR4与Sp1的表达呈正相关,且Sp1与ITGA的表达呈正相关。qRT-PCR和Western blotting结果显示,当敲减LPPR4后,Sp1的表达显着下调。当敲减Sp1后,ITGA的表达也显着下调。24.LPPR4通过调控Sp1促进胃癌细胞的迁移侵袭。Transwell实验提示沉默LPPR4同时过表达Sp1可以逆转LPPR4基因沉默对胃癌细胞的迁移和侵袭能力的抑制。25.LPPR4通过调控Sp1促进胃癌细胞粘附于PMCs。胃癌细胞与PMCs的粘附实验结果表明沉默LPPR4同时过表达Sp1可以逆转LPPR4基因沉默对胃癌细胞与PMCs之间粘附的抑制。结论:1.胃癌细胞来源的exosomes通过促进腹膜特异性PMN的形成,促进胃癌腹膜转移。2.胃癌细胞释放的Exosomal UBE3B,通过促进PMCs向CAFs的转化,进而形成腹膜特异性PMN,促进胃癌腹膜转移。3.LPPR4在胃癌腹膜转移组织高表达,是胃癌患者预后不良因素。4.LPPR4通过调控Sp1转录因子的表达进而调控integrinα表达,激活FAK、Src及AKT信号通路,活化靶基因MMP2,促进胃癌细胞的迁移、侵袭和粘附,进而促进胃癌的腹膜转移。5.Exosomal UBE3B和LPPR4可作为胃癌腹膜转移诊断和预测预后的潜在生物标志物。
二、粘着斑激酶及其在肿瘤侵袭和转移中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、粘着斑激酶及其在肿瘤侵袭和转移中的作用（论文提纲范文）
（1）磷酸甘油酸变位酶-1（PGAM1）参与调控胃癌淋巴结转移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胃癌概述介绍 |
| 1.1.1 胃癌发病率及死亡率 |
| 1.1.2 胃癌致病因素 |
| 1.1.3 胃癌治疗方法 |
| 1.1.4 胃癌预后 |
| 1.2 恶性肿瘤的转移 |
| 1.2.1 恶性肿瘤转移的机制 |
| 1.2.2 恶性肿瘤转移的过程 |
| 1.2.3 恶性肿瘤的淋巴结转移 |
| 1.2.4 胃癌转移的过程及机制 |
| 1.3 淋巴结转移相关基因的研究进展 |
| 1.4 胃癌淋巴结转移相关信号传导通路 |
| 1.5 磷酸甘油酸变位酶-1(PGAM1)与肿瘤的关系 |
| 1.6 PGAM1与其他肿瘤的关系 |
| 1.7 PGAM1与胃癌的关系 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.0 主要试剂 |
| 2.1.1 抗体信息 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 临床标本 |
| 2.1.4 细胞株 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床标本取材 |
| 2.2.2 显微切割技术 |
| 2.2.3 高通量测序分析 |
| 2.2.4 细胞培养方法 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 qPCR检测细胞中PGAM1表达水平 |
| 2.2.7 慢病毒转染及建立稳转细胞系 |
| 2.2.8 细胞增殖能力检测 |
| 2.2.9 细胞周期检测 |
| 2.2.10 细胞凋亡检测 |
| 2.2.11 划痕实验 |
| 2.2.12 Transwell实验 |
| 2.2.13 流式细胞实验检测迁移相关蛋白 |
| 2.2.14 Western Blot实验 |
| 2.2.15 小鼠荷瘤模型建立 |
| 2.2.16 免疫组化三步法染色 |
| 2.2.17 结果判定 |
| 2.2.18 临床数据分析 |
| 2.2.19 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 测序结果分析 |
| 3.1.1 差异基因表达水平聚类分析 |
| 3.1.2 差异基因表达水平火山图分析 |
| 3.1.3 差异基因GO富集性分析 |
| 3.1.4 差异基因KEGG富集性分析 |
| 3.2 差异基因验证,锁定靶基因PGAM1 |
| 3.3 敲低胃癌细胞系中PGAM1的表达 |
| 3.4 PGAM1对胃癌细胞生物学功能的影响 |
| 3.4.1 PGAM1敲低抑制了胃癌细胞增殖 |
| 3.4.2 PGAM1敲低引促进胃癌细胞的G1期停滞 |
| 3.4.3 PGAM1敲低不影响胃癌细胞的凋亡 |
| 3.4.4 PGAM1敲低能抑制胃癌细胞的迁移和侵袭 |
| 3.5 PGAM1敲低对胃癌迁移转移相关蛋白表达的影响 |
| 3.6 PGAM1受到Src、FAK、Paxillin信号转导通路调控 |
| 3.7 体内实验验证PGAM1的敲低抑制肿瘤细胞的增殖和转移 |
| 3.8 免疫组化检测PGAM1在CIS组织、癌旁组织及LNM组织中的表达差异 |
| 3.9 PGAM1在不同组织中表达情况与肿瘤患者分期的相关性分析 |
| 3.10 复发、死亡患者与无瘤生存患者PGAM1表达的差异分析 |
| 3.11 PGAM1表达与患者生存期预测分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 PGAM1在胃癌转移中作用 |
| 4.2 PGAM1在胃癌细胞的增殖和凋亡中的作用 |
| 4.3 PGAM1对转移相关信号通路的影响 |
| 4.4 PGAM1研究的临床意义 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）ROCK1/moesin激活TMEM16A钙激活氯通道促进乳腺癌迁移侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分：ROCK1通过磷酸化moesin促进乳腺癌细胞中TMEM16A通道活性 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 质粒转化和质粒小提 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 免疫蛋白印迹(Western blot) |
| 2.2.5 全细胞膜片钳电流记录 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ROCK1促进T47D细胞中TMEM16A钙激活氯电流 |
| 3.2 RhoA激活ROCK1促进乳腺癌细胞TMEM16A通道活性 |
| 3.3 Moesin T558处磷酸化促进乳腺癌细胞TMEM16A通道活性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分：Moesin促进TMEM16A钙激活氯通道促进乳腺癌细胞侵袭转移 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养和细胞转染 |
| 2.2.2 划痕实验 |
| 2.2.3 transwell细胞侵袭实验 |
| 2.2.4 transwell细胞迁移实验 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 TCGA数据库分析TMEM16A高表达与乳腺癌生存期的关系 |
| 3.2 TCGA数据库分析TMEM16A和moesin联合表达与乳腺癌生存期的关系 |
| 3.3 低表达Moesin抑制了TMEM16A促进的乳腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 3.3.1 低表达Moesin抑制TMEM16A促进的乳腺癌细胞MCF-7迁移和侵袭 |
| 3.3.2 低表达Moesin抑制TMEM16A促进的乳腺癌细胞T47D迁移和侵袭 |
| 3.4 Moesin通过T558位点磷酸化促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭 |
| 3.4.1 Moesin通过T558位点磷酸化促进乳腺癌细胞MCF-7迁移和侵袭 |
| 3.4.2 Moesin通过T558位点磷酸化促进乳腺癌细胞T47D迁移和侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 Moesin在癌症中作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）ALOX12B在宫颈癌肿瘤进展中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 宫颈癌 |
| 1.2 宫颈癌的分子机制 |
| 1.2.1 HPV与宫颈癌 |
| 1.2.2 HPV阴性宫颈癌 |
| 1.3 宫颈癌增殖、侵袭和迁移 |
| 1.3.1 宫颈癌增殖与细胞周期 |
| 1.3.2 宫颈癌迁移、侵袭和EMT |
| 1.4 ALOX12B |
| 1.4.1 ALOX12B的生物学功能 |
| 1.4.2 ALOX12B与肿瘤 |
| 1.5 实验设计和研究意义 |
| 第二章 ALOX12B加速宫颈癌细胞的增殖并促进肿瘤的生长 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验试剂 |
| 2.3.2 实验抗体 |
| 2.4 溶液配制 |
| 2.4.1 细胞培养液的配制 |
| 2.4.2 细胞裂解液 |
| 2.4.3 配制蛋白电泳溶液 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 慢病毒转染 |
| 2.5.3 实时荧光定量PCR(q-PCR) |
| 2.5.4 细胞增殖实验 |
| 2.5.5 克隆形成实验 |
| 2.5.6 划痕愈合实验 |
| 2.5.7 PI染色实验(检测细胞周期) |
| 2.5.8 蛋白免疫印迹染色(Western Blot) |
| 2.5.9 Transwell迁移侵袭实验 |
| 2.5.10 荷瘤小鼠模型 |
| 2.5.11 质粒转染 |
| 2.5.12 统计分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 靶向ALOX12B的shRNA慢病毒载体的构建和验证 |
| 2.6.2 ALOX12B在宫颈癌细胞C33A中有效表达 |
| 2.6.3 ALOX12B基因敲低抑制宫颈癌细胞增殖和克隆形成 |
| 2.6.4 体外ALOX12B对宫颈癌细胞迁移和侵袭不是必需的 |
| 2.6.5 ALOX12B基因敲低抑制宫颈癌细胞周期转换 |
| 2.6.6 ALOX12B基因敲低对抑制异种移植小鼠肿瘤生长 |
| 2.6.7 ALOX12B调控宫颈癌PI3K/ERK1 信号通路 |
| 2.7 讨论 |
| 第三章 ALOX12B调控宫颈癌PTGS2及EMT的机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验试剂 |
| 3.3.2 实验抗体 |
| 3.4 溶液配制 |
| 3.4.1 细胞培养液的配制 |
| 3.4.2 细胞裂解液 |
| 3.4.3 配制蛋白电泳溶液 |
| 3.5 实验方法 |
| 3.5.1 细胞培养 |
| 3.5.2 慢病毒转染 |
| 3.5.3 细胞增殖实验 |
| 3.5.4 蛋白免疫印迹染色(Western Blot) |
| 3.5.5 统计分析 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 ALOX12B调控宫颈癌中PTGS2表达 |
| 3.6.2 ALOX12B通过PTGS2调控宫颈癌发展 |
| 3.6.3 体内抑制ALOX12B抑制宫颈癌EMT相关信号通路 |
| 3.7 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）COX-2、PD-L1和ANXA2在腮腺良恶性肿瘤的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料与分组 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验方法 |
| 1.2.2 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 免疫组化染色结果 |
| 1.3.2 HE染色结果 |
| 1.3.3 在三种组织中COX-2、PD-L1和ANXA2 的表达情况及其差异性 |
| 1.3.4 在腮腺恶性肿瘤中,COX-2、PD-L1和ANXA2 的表达情况与临床因素间的关系 |
| 1.3.5 C0X-2、PD-L1和ANXA2 在恶性腮腺肿瘤中表达的相关性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 分子水平的诊断对颌面外科肿瘤诊治的意义 |
| 1.4.2 COX-2在腮腺恶性肿瘤中差异性表达的意义 |
| 1.4.3 PD-L1在恶性腮腺肿瘤中表达差异性的意义 |
| 1.4.4 ANXA2在腮腺恶性肿瘤的差异性表达及其意义 |
| 1.4.5 COX-2、PD-L1和ANXA2 在恶性腮腺肿瘤中表达水平的关系 |
| 1.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 Annexin A2对癌症的作用及机制 |
| 2.1 Annexin家族 |
| 2.1.1 Annexin家族概述 |
| 2.1.2 Annexins的演变 |
| 2.1.3 Annexins的分子结构 |
| 2.1.4 Annexins的生化特性 |
| 2.2ANXA2 |
| 2.2.1 ANXA2概述 |
| 2.2.2 ANXA2基本结构 |
| 2.2.3 ANXA2的生理功能 |
| 2.2.4 ANXA2与其他蛋白的相互作用 |
| 2.2.5 ANXA2表达与癌症的关系 |
| 2.2.6 ANXA2在肿瘤细胞学行为中的表现和影响 |
| 2.2.7 对ANXA2表达调控的研究进展 |
| 2.3 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（6）肿瘤相关成纤维细胞的自噬水平在其促进肺癌细胞转移中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| (一)肺癌现状和治疗 |
| (二)CAFs及其在肿瘤转移中的作用 |
| (三)自噬依赖的分泌及其在肿瘤中的作用 |
| (四)HMGB1与肿瘤生长、转移 |
| (五)NF-κB信号通路与肿瘤生长、转移 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1.1 细胞和实验动物 |
| 1.1.1 细胞系和组织 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.2 实验试剂和器材 |
| 1.2.1 主要实验试剂 |
| 1.2.2 主要实验仪器和耗材 |
| 1.2.3 试剂配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 Western blot操作步骤 |
| 1.3.3 Real-time PCR |
| 1.3.4 自噬水平检测 |
| 1.3.5 吖啶橙染色 |
| 1.3.6 细胞转染siRNA |
| 1.3.7 细胞增殖实验 |
| 1.3.8 细胞划痕实验 |
| 1.3.9 Transwell小室实验 |
| 1.3.10 酶联免疫分析(ELISA) |
| 1.3.11 小鼠成瘤实验 |
| 1.3.12 数据分析 |
| 结果 |
| 2.1 肺癌的CAFs具有较高的基础自噬水平 |
| 2.1.1 成纤维细胞的分离、培养、鉴定 |
| 2.1.2 肺癌CAFs的基础自噬水平高于NFs |
| 2.2 抑制CAFs的自噬可以减弱CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用 |
| 2.2.1 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs对肺癌细胞增殖的促进作用 |
| 2.2.2 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs对肺癌细胞侵袭转移的促进作用 |
| 2.2.3 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs促进肺癌细胞中转移相关基因的表达及EMT |
| 2.3 激活CAFs的自噬可以增强CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用 |
| 2.3.1 激活CAFs的自噬能够增强CAFs对肺癌细胞增殖的促进作用 |
| 2.3.2 激活CAFs的自噬能够增强CAFs对肺癌细胞侵袭转移的促进作用 |
| 2.4 CAFs分泌的HMGB1 可调节自身的自噬水平 |
| 2.4.1 调控CAFs的自噬水平可影响CAFs分泌HMGB1 |
| 2.4.2 HMGB1 可以上调CAFs的自噬水平 |
| 2.5 CAFs分泌的HMGB1 可通过激活TLR4/NF-κB信号通路促进肺癌细胞增殖和侵袭转移 |
| 2.5.1 CAFs可通过分泌HMGB1 促进肺癌细胞的增殖 |
| 2.5.2 CAFs可通过分泌HMGB1 促进肺癌细胞的侵袭转移 |
| 2.5.3 CAFs可通过分泌HMGB1 促进肺癌细胞中转移相关基因的表达及EMT的发生 |
| 2.5.4 抑制HMGB1 可减弱CAFs对肺癌细胞侵袭转移的促进作用 |
| 2.5.5 CAFs的自噬水平在CAFs激活肺癌细胞中TLR4/NF-κB信号通路中的作用 |
| 2.5.6 CAFs可通过分泌HMGB1 激活肺癌细胞中的TLR4/NF-κB信号通路 |
| 2.6 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs对肺癌细胞体内的生长的促进作用 |
| 2.6.1 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs对肺癌细胞体内生长的促进作用 |
| 2.6.2 抑制CAFs的自噬能够削弱CAFs对肺癌细胞EMT及 TLR4/NF-κB信号通路的激活作用 |
| 讨论 |
| 3.1 CAFs的自噬水平 |
| 3.2 CAFs的自噬水平在CAFs促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移中的作用 |
| 3.3 CAFs的自噬水平影响HMGB1 的分泌且HMGB1 可调节CAFs的自噬水平 |
| 3.4 HMGB1在CAFs促进肺癌细胞增殖和转移中的作用 |
| 3.5 CAFs的自噬水平在CAFs促肿瘤生长、转移中的作用及靶向治疗 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤相关成纤维细胞中自噬作用的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）细胞粘附分子SVEP1参与调控肝癌恶性进展的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、SVEP1的低表达与肝癌的不良预后密切相关 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 纳入研究的患者组织标本 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂耗材 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.1.4 主要实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 转录组测序结果表明高复发风险组的肝癌样本SVEP1呈现显着低表达 |
| 1.2.2 生物数据库分析提示肝癌中SVEP1的低表达与不良预后密切相关 |
| 1.2.3 新鲜组织免疫印迹法证实SVEP1在肝癌中低表达 |
| 1.2.4 免疫组化法进一步证实肝癌低表达SVEP1提示不良预后 |
| 1.2.5 SVEP1高表达是高危亚组肝癌患者的保护因素 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、降表达SVEP1可促进肝癌细胞恶性表型的转化 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂耗材 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 GSEA分析证实低表达SVEP1 与肝癌增殖和侵袭转移正相关 |
| 2.2.2 构建并验证SVEP1稳定降表达的肝癌细胞系 |
| 2.2.3 侵袭实验证实降表达SVEP1可增强肝癌细胞的侵袭能力 |
| 2.2.4 趋化实验证实降表达SVEP1可增强肝癌细胞的趋化能力 |
| 2.2.5 高内涵显微镜运动实验和划痕实验证实降表达SVEP1可增强肝癌细胞的运动能力 |
| 2.2.6 CCK-8 实验证实降表达SVEP1 可增强肝癌细胞的增殖能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、miR-1269b可直接抑制SVEP1 的转录水平 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 主要仪器和试剂耗材 |
| 3.1.2 主要溶液配制 |
| 3.1.3 主要实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 全转录组测序分析联合公共数据库发现miR-1269b是潜在调控SVEP1转录水平的上游分子 |
| 3.2.2 双荧光素酶报告实验证实miR-1269b可以直接调控SVEP1 转录水平 |
| 3.2.3 验证干扰miR-1269 的表达对SVEP1 表达水平的调控作用 |
| 3.2.4 过表达miR-1269b肝癌细胞系侵袭迁移能力显着增强 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、降表达SVEP1 通过激活PI3K/Akt通路促进肝癌进展 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂耗材 |
| 4.1.2.1 主要试剂耗材、抗体和引物 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.1.4 主要实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RNA-seq提示不同SVEP1 表达水平的Hep3B细胞系中的差异基因显着富集于PI3K/Akt信号通路 |
| 4.2.2 Heatmap图分析SVEP1 降表达后PI3K/Akt通路激活的差异基因 |
| 4.2.3 RT-PCR实验验证RNA-seq测序数据中PI3K/Akt通路上调的差异基因 |
| 4.2.4 降表达SVEP1 通过激活p Akt308位点进而激活PI3K/Akt信号通路 |
| 4.2.5 降表达SVEP1 通过激活PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞的增殖和侵袭转移 |
| 4.2.6 体内实验证实降表达SVEP1促进小鼠肿瘤体积的增大 |
| 4.2.7 体内实验中,降表达SVEP1组Hep3B细胞转移能力较强 |
| 4.2.8 体内实验中,降表达SVEP1 的小鼠组织中p-AKT308及PKCζ表达升高 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞粘附分子在肿瘤中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）新型脂肪因子CTRP6促进卵巢癌网膜转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1.转移前微环境的研究发生发展过程 |
| 2.转移前微环境形成机制 |
| 3.卵巢癌转移前微环境研究现状 |
| 4.脂肪细胞在卵巢癌转移中发挥的作用 |
| 5.本研究主要分为三个部分 |
| 第一章 筛选促进卵巢癌网膜转移形成的差异基因 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 CTRP6 表达对卵巢癌细胞网膜转移能力的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 CTRP6 调控卵巢癌网膜转移微环境的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表和待发表的学术论文目录 |
（9）Slit2-Robo1信号通过活化Src诱导E-cadherin磷酸化及上皮-间质转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 Slit2-Robo1与E-cadherin、Src的关系 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 结论 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 Slit2-Robo1激活Src引起E-cadherin降解的机制 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 结论 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Src-Robo 1-E-cadherin复合物在E-cadherin磷酸化和EMT过程中的作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 结论 |
| 3.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（10）Exosomal UBE3B及LPPR4促进胃癌腹膜转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 Exosomal UBE3B诱导腹膜“龛”的形成促进胃癌腹膜转移的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 外泌体的提取与定量 |
| 2.2.3 电镜观察外泌体的形态 |
| 2.2.4 Nano Sight分析检测外泌体直径 |
| 2.2.5 外泌体的DID标记内化实验 |
| 2.2.6 Transwell迁移实验 |
| 2.2.7 肿瘤细胞-腹膜间皮细胞粘附实验 |
| 2.2.8 细胞免疫荧光 |
| 2.2.9 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.2.10 腹膜高转移胃癌细胞系和胃癌细胞系差别的体内验证 |
| 2.2.11 外泌体诱导的胃癌腹膜转移动物模型 |
| 2.2.12 小动物PET |
| 2.2.13 胃癌腹膜转移患者腹膜组织标本 |
| 2.2.14 免疫组化 |
| 2.2.15 小鼠腹膜组织免疫荧光 |
| 2.2.16 全转录组测序 |
| 2.2.17 稳定的UBE3B过表达细胞系的构建 |
| 2.2.18 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 腹膜PMN的形成促进胃癌腹膜转移 |
| 3.2 腹膜高转移胃癌细胞系MKN45P的建立及验证 |
| 3.3 胃癌细胞来源exosomes的提取和内化的验证 |
| 3.4 腹膜高转移胃癌细胞MKN45 P来源的exosomes促进PMCs的迁移 |
| 3.5 腹膜高转移胃癌细胞MKN45P来源的exosomes促进胃癌细胞粘附于PMCs |
| 3.6 腹膜高转移胃癌细胞MKN45P来源的exosomes促进PMCs向 CAFs转化 |
| 3.7 腹膜高转移胃癌细胞MKN45 P分泌的exosomes促进裸鼠腹膜转移瘤形成 |
| 3.8 腹膜高转移胃癌细胞MKN45 P来源的exosomes促进裸鼠PMCs向 CAFs转化 |
| 3.9 Exosomal UBE3B是参与腹膜特异性PMN形成的关键性分子 |
| 3.10 胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B过表达及内化的验证 |
| 3.11 胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B增强PMCs的迁移能力 |
| 3.12 胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B促进胃癌细胞粘附于PMCs |
| 3.13 胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B促进PMCs向 CAFs转化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 LPPR4在胃癌腹膜转移中的作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 数据收集和预处理 |
| 2.2.2 差异表达基因的筛选鉴定 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 siRNA转染 |
| 2.2.5 RNA提取和实时定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.6 稳定的LPPR4敲除细胞系的构建 |
| 2.2.7 过表达质粒转染 |
| 2.2.8 细胞活力测定 |
| 2.2.9 Transwell迁移侵袭实验 |
| 2.2.10 伤口愈合实验 |
| 2.2.11 肿瘤细胞-腹膜间皮细胞粘附实验 |
| 2.2.12 免疫共沉淀和蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.2.13 体内胃癌腹膜转移模型 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学筛选胃癌不良预后和腹膜转移相关基因 |
| 3.1.1 在TCGA-STAD数据集中筛选胃癌肿瘤组织和相邻正常组织的差异表达基因 |
| 3.1.2 在TCGA-STAD和 GSE62254 数据集中筛选具有胃癌不良预后价值的差异表达基因 |
| 3.1.3 在GSE62254数据集中筛选与胃癌腹膜转移相关的差异表达基因 |
| 3.1.4 在TCGA-STAD和 GSE62254 数据集中筛选在胃癌中既具有不良预后价值又与腹膜转移相关的差异表达基因 |
| 3.2 LPPR4与胃癌患者不良预后相关并在胃癌腹膜转移患者中高表达 |
| 3.2.1 在TCGA-STAD和 GSE62254 数据集中,LPPR4 高表达胃癌患者预后不良 |
| 3.2.2 在GSE62254 数据集中,LPPR4 在胃癌腹膜转移患者中高表达 |
| 3.2.3 LPPR4可作为预测胃癌腹膜转移的生物标志物 |
| 3.3 LPPR4促进胃癌腹膜转移 |
| 3.3.1 LPPR4在胃癌细胞系中表达上调 |
| 3.3.2 LPPR4在胃癌细胞系中的转染效率验证 |
| 3.3.3 LPPR4促进胃癌细胞迁移侵袭 |
| 3.3.4 LPPR4促进胃癌细胞粘附于腹膜间皮细胞 |
| 3.3.5 体内实验证实LPPR4促进胃癌腹膜转移 |
| 3.4 LPPR4与细胞粘附分子通路相关 |
| 3.4.1 京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesand Genomics,KEGG)分析 |
| 3.4.2 基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA) |
| 3.5 LPPR4 参与调节integrinα/FAK信号通路 |
| 3.6 LPPR4 通过Sp1 转录因子调控integrinα 的表达 |
| 3.7 LPPR4 通过调节Sp1 的活性进而促进胃癌细胞的迁移,侵袭和粘附 |
| 3.7.1 LPPR4 通过调控Sp1 促进胃癌细胞的迁移侵袭 |
| 3.7.2 LPPR4 通过调控Sp1 促进胃癌细胞粘附于PMCs |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、粘着斑激酶及其在肿瘤侵袭和转移中的作用（论文参考文献）
- [1]磷酸甘油酸变位酶-1（PGAM1）参与调控胃癌淋巴结转移的分子机制研究[D]. 王贺雷. 吉林大学, 2021(01)
- [2]ROCK1/moesin激活TMEM16A钙激活氯通道促进乳腺癌迁移侵袭的机制研究[D]. 陈奕雯. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]ALOX12B在宫颈癌肿瘤进展中的作用和机制研究[D]. 江涛. 南昌大学, 2020(08)
- [4]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [5]COX-2、PD-L1和ANXA2在腮腺良恶性肿瘤的表达[D]. 常渊. 华北理工大学, 2020(02)
- [6]肿瘤相关成纤维细胞的自噬水平在其促进肺癌细胞转移中的作用机制研究[D]. 任莹慧. 天津医科大学, 2020(06)
- [7]细胞粘附分子SVEP1参与调控肝癌恶性进展的分子机制研究[D]. 刘东明. 天津医科大学, 2020(06)
- [8]新型脂肪因子CTRP6促进卵巢癌网膜转移的机制研究[D]. 白一涵. 上海交通大学, 2020(01)
- [9]Slit2-Robo1信号通过活化Src诱导E-cadherin磷酸化及上皮-间质转化的研究[D]. 谭琪. 南方医科大学, 2020(01)
- [10]Exosomal UBE3B及LPPR4促进胃癌腹膜转移的机制研究[D]. 臧丹. 中国医科大学, 2020(01)