一、转苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因抗虫水稻的GUS和PCR辅助选择（论文文献综述）
崔彦芹[1]（2016）在《转Bt-pta基因水稻后代分子检测与抗虫性鉴定》文中提出水稻是世界上最重要粮食作物之一,世界上近半数人口以稻米为食。一直以来,虫害是危害水稻产量的重要因素之一,而利用转基因技术培育抗虫水稻,可以有效解决这个问题。本研究以优良水稻恢复系辐恢838为受体材料,采用农杆菌介导法,将重组表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta转入其中,通过报告基因GUS表达检测,目的基因PCR检测,筛选出阳性T0代转基因水稻;将其收获后种植,对其进行报告基因GUS表达检测,及目的基因PCR检测,检测出T1代双价转基因水稻,对其进行抗虫性鉴定;将抗虫效果较好的双价转基因水稻收获后种下,得到T2代转基因水稻,每个株系取10株,对目的基因进行PCR检测,获得纯合的双价抗虫转基因水稻。本论文获得的具体结果如下:1.构建双价植物表达载体:首先构建中间载体,用HindⅢ和SpeI分别对基础表达载体pCAMBIA1301和质粒pUC57-Bt进行双酶切,回收目的基因Bt和载体骨架pCAMBIA1301,然后通过T4 DNA连接酶将目的基因连接到载体骨架上,构建中间载体pCAMBIA1301-Bt;然后用HindⅢ分别酶切pCU57-pta与中间载体pCAMBIA1301-Bt,回收目的基因与中间载体骨架,再用T4 DNA连接酶将目的基因pta连接到中间载体骨架上,成功构建植物表达质粒pCAMBIA1301-Bt-pta。2.T0代转基因水稻的获得及初步检测:用农杆菌介导法将双价植物表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta转化优良水稻恢复系辐恢838,经驯化后移栽共获得105株再生植株,经过GUS化学组织染色及PCR检测,最终得到3个T0代转双价基因阳性转化子。3.T1代转基因水稻的分子检测及抗虫性鉴定:将分单株收获的T0代转基因水稻种子种下,得到T1代转基因水稻株系,检测其报告基因GUS表达水平,并对初步检测出的阳性植株进行目的基因PCR检测、Bt毒蛋白表达酶联免疫检测以及室内和室外的抗虫性检测,共检测出29株抗虫效果较好的双价转基因水稻,并对其农艺性状进行考察。4.T2代纯合双价转基因水稻的获得:分单株收获T1代29株抗虫效果较好的双价转基因水稻,种植获得29个株系,每个株系随机取10株,PCR法检测目的基因,10株全含目的基因的株系共29个,该29株系即为目的基因纯合株系,为以后组配杂交组合,获得抗虫杂交水稻提供恢复系材料。
何禹璇[2]（2013）在《大豆子叶节遗传转化体系优化及转Cry1Iem基因抗虫新材料的获得》文中进行了进一步梳理大豆（Glycine max L.Merrill）作为重要的粮食作物及经济作物,其产量与品质长期受虫害威胁,虽然采用化学药剂防治虫害具有较好的防治效果,但具有防治成本较高,造成环境污染等缺点。近年来,选育抗虫品种成为防治大豆虫害的一个主要趋势,通过传统的育种手段选育抗虫品种周期长,操作性低,常常受物种间杂交不亲和性和不良性状连锁的限制。植物基因工程的发展,为抗虫大豆新品种的生产和育种提供了新途径,建立良好的大豆再生体系是实现基因遗传转化的前提。本研究的主要目的是对影响农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的几个因素进行优化研究,并将带有抗虫基因Cryllem的植物表达载体pTF101-35S-cry1Iem-Nos通过农杆菌介导大豆子叶节再生体系的方法转入大豆中,主要研究结果如下：1.针对不同农杆菌菌株,不同大豆子叶节丛生芽的诱导影响亲和力不同,农杆菌菌株毒性过强不利于再生植株的获得；2.通过对农杆菌菌液浓度、表面活性剂、抗氧化剂、共培养时间等因素的研究,优化了农杆菌介导大豆子叶节再生体系。GUS染色结果表明OD600为0.8-1.0的农杆菌菌液并添加表面活性剂可以有效提高农杆菌的侵染效率,在共培养过程中添加400mg.L-1半胱氨酸,154mg·L-1二硫苏糖醇,25mg·L-1α-硫辛酸既能有效控制外植体的褐化和白化现象,又能获得较高的丛生芽诱导率。参照此优化体系,70天左右即可获得再生苗,转化率可达到6～8%左右。3.利用植物克隆载体pUC57-crylIem,与表达载体pCAMBIA3300-35S-phy-Nos, pTF101.1重组改建后获得植物表达载体pTF101-35S-cry1Iem-Nos。重组表达载体筛选标记基因为bar基因,构建获得的重组载体转入EHA101和EHA105两种农杆菌中。4.采用农杆菌介导大豆子叶节再生体系的方法,以大豆品种William82为受体材料,经过分子水平检测及抗虫性鉴定后,共获得69株转CrylIem的阳性苗。关于该抗虫新材料的遗传稳定性及大田试验表现,还需进一步试验研究。
董方[3]（2012）在《苏云金杆菌嵌合杀虫蛋白的构建与毒性分析》文中研究表明作为重要的杀虫微生物,苏云金芽胞杆菌（.Bacillus thuringiensis,简称Bt.）被越来越多的应用在生物防治与转基因领域,但是当今生物杀虫剂面临的一个最为重要的问题是农业害虫日益增长的抗药性。因此,开发出更多苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因和寻找减缓昆虫抗性的方法,成为当今生物防治和转基因领域的热点。苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Protein,简称VIPs）被誉为第二代生物杀虫剂,与传统上应用最为广泛的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Protein,简称ICPs）相比,具有完全不同杀虫机理和杀虫谱。目前单独的VIPs和单独的ICPs转基因作物已经培育成功。然而,对于VIPs和ICPs两种蛋白协同使用的研究报道较少。鉴于此,本论文利用本室保存的一种密码子优化后的营养期杀虫蛋白基因vip3Aa7与其余几种优化后的cry杀虫晶体蛋白基因构建了几种新型的嵌合杀虫蛋白基因,并研究了杀虫活性,主要结果如下：1.Bt.嵌合杀虫蛋白植物表达载体及pCPANEK通用植物表达载体的构建利用增强子翻倍的CaMV35S启动子,TmvΩ和Kazak翻译增强序列以及PolyA识别剪切序列,PolyA尾序列以及Nos强终止子序列为表达元件,植物表达载体pCAMBIA2300为骨架构建出pCPANC1C, pCPANC2A, pCPANC9C单价植物表达载体,以及pCPANV3AC1C, pCPANV3AC2A, pCPANV3AC9C三种双价嵌合蛋白植物表达载体。利用上述表达元件和pCAMBIA2300载体,人工构建出一个通用性的植物表达载体pCPANEK,特点是在5’和3’表达框中间添加一段肠激酶切点（EK site）,可方便的直接构建双价嵌合蛋白,免除了分步克隆操作的繁琐。2.嵌合杀虫蛋白V3AC9C具有高效的杀虫活性,其毒力增加主要来自溶解度提高利用vip3Aa7与Cry1Ca,Cry2Aa,Cry9Ca等基因发明出一种嵌合蛋白的构建方法,将vip3Aa7基因置于5’端,保留N-半段cry基因置于3’端。构建出嵌合蛋白和各个单价杀虫蛋白使用带有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-1在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中重组表达。结果表明：绝大部分蛋白在BL21中得到正确的表达。生物测定表明,使用Vip3Aa7和N-半段的Cry9Ca构建出的嵌合蛋白V3AC9C对小菜蛾具有非常高的毒力,半致死浓度（LC50）为0.322μg/mL,表达量为单价的N-半段Cry9Ca的61.3%。使用胰蛋白酶对V3AC9C进行切割激活,表明嵌合蛋白能被正确的切割成单独的Vip3Aa7的62kDa核心毒性片段和Cry9Ca的55kDa最终降解片段。将Vip3Aa7和N-半段Cry9Ca按照1：1质量比混合后作为对照,测定嵌合蛋白V3AC9C协同作用。发现V3AC9C的毒力甚至要高出混合毒素3.2倍。计算V3AC9C中Vip3Aa7和Cry9Ca的协同系数高达4.7,而混合毒素中的协同系数仅有1.5。溶解度分析和显微镜检测表明,在嵌合蛋白中Vip3Aa7可以帮助Cry9Ca溶解在碱性缓冲体系中,并证明嵌合蛋白V3AC9C的毒力增加主要来自于提高的溶解度。本次试验首次将Vip3A类蛋白与Cry类蛋白构建出嵌合蛋白,并且证明此种构建方式的可行性。构建出的嵌合蛋白V3AC9C高毒的特性和低表达量,使其可能成为一种非常有潜力的转基因材料。3.苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa7半胱氨酸突变体的研究Bt.杀虫蛋白的毒性跟溶解度密切相关。生物信息学发现Vip3Aa7蛋白含有三个非常保守的半胱氨酸残基（Cys292,Cys401,Cys507）。为了研究这三个半胱氨酸残基对毒性的影响,利用定点突变技术,将这3个半胱氨酸残基替换成丝氨酸,以期待能够增加毒性。三个突变体表达后测定溶解度均比野生型有了一定的提高。但是生测结果表明,突变体毒力并未提高,而且C401S和C507S均完全丧失了毒性。进一步研究发现,突变体C292S,C401S和野生型的Vip3Aa7均可被胰蛋白酶正确消化成62kDa核心毒性片段,但C507S明显降解,由此推测出C507S毒力丧失是因为原因其对胰蛋白酶变得敏感。以上结果表明,Cys507对维持Vip3Aa7蛋白稳定具有重要作用。本次研究尝试虽未得到毒力增加的突变体,但为今后提高其他Bt.蛋白毒力提供了思路,为研究Vip3A蛋白杀虫机理也提供了新线索。
冯妍[4]（2010）在《塔形毛白杨CV-BJHR01再生体系的建立及Bt抗虫基因工程的研究》文中研究指明杨树是我国重要的生态防护林与工业用材树种。但是杨树虫害严重,每年因虫害造成了巨大的经济损失。随着杨树抗虫基因工程的发展,一些重要的抗虫基因,特别是Bt基因,已经成功用于杨树病虫害的防治,并取得了丰硕的成果。本研究以华北地区优良的生产品种塔形毛白杨CV-BJHR01（Populus tomentosa Carr. cv’BJHROl’）为受体材料,以经改造的Bt886cry3Aa基因为目的抗虫基因,经过组培再生体系的建立、遗传转化系统的验证、抗虫基因的转化等一系列研究,培育出表达Bt蛋白的转基因毛白杨新品系。具体取得以下结果：（1）对培养基配方、培养条件以及外植体类型进行探索,建立并优化了塔形毛白杨CV-BJHR01的组培再生体系。这对于优良品种的推广和种质资源的保存具有重要意义,同时为基因工程育种奠定基础,也为促进农林复合生态系统的健康发展提供了科技支撑。（2）通过对gus基因的瞬时表达检测,建立并验证了整个遗传转化系统的可行性。同时对转化体的抗性筛选压进行了摸索,确定了最适的抗生素筛选浓度,为抗虫基因的顺利转化奠定了基础。（3）通过农杆菌介导的遗传转化,将目的基因转入了塔形毛白杨CV-BJHR01的基因组中,PCR检测确定64株为转基因阳性植株。PCR-Southern杂交进一步验证了PCR检测结果。利用mBt-Cry3A ImmunoStrip检验目的抗虫基因在植物体内是否有蛋白表达,结果表明,64株PCR阳性植株中有12株呈蛋白阳性反应,以mBt-Cry3A ELISA实验再次验证呈蛋白阳性反应的植株,发现其OD600的吸光度普遍高于对照植株,证明已获得多个抗虫毛白杨转基因株系。
霍雪梅[5]（2009）在《抗虫基因植物表达载体构建、遗传转化及表达研究》文中研究说明本研究在王彦平构建的植物表达载体基础上构建Bt抗虫基因表达载体,并转化烟草,对Bt基因表达水平进行检测。试验进一步以普通741杨和转双抗虫基因pB29无菌苗为试验材料,建立了叶片再生体系并对农杆菌介导的遗传转化体系进行了优化。通过农杆菌介导法将Bt cry3A （Bt3）基因转入已含Bt cry1A（c） （Bt1）基因的pB29中,获得转双Bt基因741毛白杨,对部分转化植株进行了DNA水平和蛋白质水平的检测。主要研究结果如下:利用植物表达载体pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3,通过DNA重组技术,分别将Bt1和Bt3基因正向插入植物表达载体pCAMBIA3301中,成功构建了pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3植物表达载体。此可读框架通过组成型启动子CaMV35S启动,携带PPT乙酰基转移酶（PAT）基因作为选择标记基因,并将构建的表达载体导入根癌农杆菌EHA105。确定烟草转化的潮霉素临界筛选浓度为50 mg.L-l,头孢噻肟钠的抑菌浓度为200 mg.L-l。采用农杆菌介导法,将植物表达载体载体pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3及构建的植物表达载体pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3转入烟草中,均得到完整再生植株。经PCR检测,初步证明目的基因已整合到烟草的基因组中。ELISA检测表明,大部分转基因株系中Bt1和Bt3毒蛋白表达量均高于对照。在5株携带双价Bt基因的转基因烟草中,Bt1毒蛋白和Bt3毒蛋白的表达量最高分别达0.030 1%和0.293 8%。对农杆菌介导的741杨遗传转化体系进行了优化,确定叶片诱导分化不定芽的适宜培养基为MS+ 6-BA 1.0 mg.L-l + NAA 0.1 mg.L-l,生根培养基为1/2 MS+ NAA 0.1 mg.L-l。潮霉素临界筛选浓度为10 mg.L-l,抗生素头孢噻肟钠的抑菌浓度为400 mg.L-l。遗传转化的适宜菌液浓度为OD600 = 0.4,浸菌时间为810 min,共培养时间以2 d为宜。采用农杆菌介导法,将Bt3基因转入已转Bt1基因的杂种741毛白杨无性系pB29中,获得转双Bt基因741毛白杨。在含Hyg的培养基中进行多次继代筛选,获得抗性稳定的无性系9个,编号为pC1pC9。采用特异引物分别对获得的转双Bt基因741杨无性系进行PCR检测,结果表明:Bt1基因稳定存在于pB29无性系中,Bt3基因已整合到各无性系的基因组DNA中。对杂种741毛白杨转化植株进行毒蛋白表达的ELISA检测,结果表明,所选转双价Bt基因的741杨的2个无性系pC1和pC2,均检测到Bt1和Bt3毒蛋白的表达。Bt1毒蛋白的表达量分别为0.009 4%和0.011 0%;Bt3毒蛋白的表达量分别为0.217 0%和0.149 4%,高于对照pB29及转单一Bt3基因的741杨无性系CC71的Bt3蛋白表达量（0.033 7%）。
徐健[6]（2008）在《粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌增效作用及应用》文中进行了进一步梳理苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是研究应用最为广泛的生物杀虫剂,实际使用中存在作用速度慢、防效低等弱点。美洲粘虫颗粒体病毒（Pseudaletia unipuncta granulosis virus , PuGV ）是含有增效蛋白（ enhancin）的杆状病毒（Baciluvirus）,能提高核型多角体病毒（nuclear polyhedrosis virus,NPV）的侵染能力及Bt的毒力。本文以Bt和东方粘虫P. separata转主增殖的美洲粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）为材料,明确了PuGV-Ps对Bt的增效作用和增效特性;并从PuGV-Ps对杀虫晶体蛋白的酶解活化、昆虫中肠酶活性的变化、昆虫中肠围食膜（peritrophic membrane,PM）结构的破坏等方面探索了增效机理;克隆和测序了PuGV-Ps增效蛋白基因并原核表达了增效蛋白;研制了PuGV-Ps对Bt的增效制剂,并明确了其应用效果。主要结果如下:1明确了PuGV-Ps对Bt的增效作用以小菜蛾Plutella xylostella、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、棉铃虫Helicoverpa armigera为试虫,采用生物测定方法测定了PuGV-Ps对Bt制剂的增效作用。结果表明Bt中加入PuGV-Ps对3种鳞翅目害虫都具有增效作用,共毒系数达127-146。高温灭活的PuGV-Ps对Bt同样具有增效作用,对小菜蛾的共毒系数达135.8,说明PuGV-Ps中含有对Bt毒力增强作用的增效因子。PuGV-Ps可以提高Bt对小菜蛾的杀虫速度,250μg/mL浓度的Bt中加入PuGV-Ps较单用Bt致死中时间LT50缩短了37.8%。转Bt基因的抗虫棉叶经PuGV-Ps处理后饲喂棉铃虫死亡率也得到相应提高。PuGV-Ps还能增强Bt对甜菜夜蛾生长发育的抑制作用,表现为幼虫生长量相对减少、蛹重下降、化蛹率降低和化蛹历期延长。2分离纯化了PuGV-Ps增效蛋白并测定其对Bt的增效活性用PuGV感染东方粘虫获得的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps的包涵体中含有分子量为108 kD的增效蛋白。PuGV-Ps经碱溶、Sephadex G-200凝胶过滤层析分离获得部分纯化的增效蛋白。以小菜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫等3种鳞翅目昆虫为试虫测定部分纯化的增效蛋白对Bt的增效作用,联合作用的共毒系数在116-155之间,表明PuGV-Ps增效蛋白是一种增效因子,可以增强Bt鳞翅目昆虫的毒力。3探明了PuGV-Ps对Bt增效作用的影响因子PuGV-Ps对Bt的增效程度随PuGV-Ps量的变化而不同,试验范围内不同配伍的PuGV-Ps和Bt间的共毒系数在105.3至195.0之间,其中以Bt∶PuGV-Ps为4∶1增效作用最明显,72 h LC50为0.039 mg/mL。不同温度和pH都影响PuGV-Ps对Bt的增效作用,16℃20℃增效程度明显高于24℃32℃,而碱性条件下（pH 8-9）增效作用更显着。PuGV-Ps对Bt的增效作用因小菜蛾龄期不同而变化,2、3龄幼虫试验,小菜蛾死亡率较Bt分别提高了50%和30.31%,而对低龄（1龄）和高龄（4龄）幼虫增效不显着。PuGV-Ps饲喂2 h后接毒Bt,小菜蛾死亡率明显提高,48 h死亡率达66.67%,较Bt+PuGV-Ps处理死亡率提高了53.87%,差异显着。4分析了PuGV-Ps对苏云金杆菌δ-内毒素的酶解活化作用用氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物测定PuGV-Ps中总蛋白酶活力表明,PuGV-Ps在pH 7.38-10.38的碱性条件下均具有一定的蛋白酶活性,且蛋白酶活力随pH的升高而显着提高。4种蛋白酶抑制剂都能抑制PuGV-Ps的蛋白酶活力,以大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）的抑制作用最强,表明PuGV-Ps的蛋白酶活性是以胰蛋白酶为主要活力的多种蛋白酶的活性特征。通过SDS-PAGE研究了PuGV-Ps对苏云金杆菌δ-内毒素的降解活化作用,结果表明,碱性条件下Bt晶体蛋白和PuGV-Ps共同孵育,130 kD的δ-内毒素被进一步酶解成分子量为110 kD、87 kD、61 kD、47 kD等多种不同分子量的肽链,其酶解活化程度随缓冲液pH的升高而加深,在pH 10.7的0.1 mol Na2CO3缓冲液中,δ-内毒素被完全酶解,产生具有一定抗蛋白酶继续降解能力的分子量为47 kD、60 kD和61 kD的活性片段。同时PuGV-Ps量的多少和碱解时间都影响δ-内毒素的酶解活化程度,STI能一定程度抑制PuGV-Ps对δ-内毒素的酶解活化。5明确了PuGV-Ps抑制甜菜夜蛾中肠液对δ-内毒素的过度降解PuGV-Ps具有蛋白酶活性,对甜菜夜蛾中肠酶液离体蛋白酶活力及取食PuGV-Ps后总蛋白酶活力影响测定表明,在中肠酶液适宜pH范围（pH 9.38-10.38）内,PuGV-Ps都一定程度抑制了中肠酶液的总蛋白酶活力。SDS-PAGE试验显示,PuGV-Ps影响了甜菜夜蛾中肠酶液对苏云金杆菌δ-内毒素的降解活化作用,表现在对中肠酶液酶解130 kD的δ-内毒素成60 kD-87 kD的较大分子量的活性多肽无明显影响,但对活性多肽的进一步降解具有抑制作用,这种过度降解的抑制作用在25℃-30℃的温度和随酶解时间的延长更为显着。不同缓冲液同样影响甜菜夜蛾中肠酶液对δ-内毒素的降解,Na2CO3盐的存在是影响降解程度的重要因子。6证实了PuGV-Ps并发现Bt对甜菜夜蛾中肠PM结构的破坏作用利用环境扫描电镜和SDS-PAGE电泳技术研究了Bt、PuGV-Ps及其增效蛋白对甜菜夜蛾中肠PM的影响。电镜观察结果表明,正常的甜菜夜蛾PM外壁有韧性,表面较平滑,少皱褶,内壁表面较粗糙,有较厚质感,无孔洞和缝隙;取食PuGV-Ps或增效蛋白后的PM外壁皱缩,内壁平滑、质薄;Bt单独作用于PM同样改变了围食膜结构,但影响程度较小;但不同处理未发现对甜菜夜蛾PM造成穿孔或裂缝。中肠PM蛋白的SDS-PAGE试验表明,取食PuGV-Ps和增效蛋白后,PM上200 kD、150 kD、80 kD的大分子量的蛋白一定程度被降解成78 kD以下的小分子量蛋白带,小分子量27 kD的蛋白也被部分降解,而分子量为28 kD的小分子蛋白同时被完全降解;Bt也影响了PM蛋白的构成,取食Bt的PM蛋白电泳减少了28 kD的小分子蛋白,说明甜菜夜蛾PM上28 kD的蛋白是PuGV-Ps增效蛋白和Bt的共同靶蛋白。离体降解试验进一步证明Bt及增效蛋白对甜菜夜蛾PM上28 kD蛋白具有降解作用。7克隆和测序了PuGV-Ps增效蛋白的全长基因以PuGV-Ps的DNA为模板,参考粉纹夜蛾颗粒体病毒（TnGV）和棉铃虫颗粒体病毒（HaGV）的增效蛋白基因序列设计引物,通过PCR反应扩增出一条2.7 kb的特异性基因片段。纯化的PCR产物克隆到载体质粒pEASY-E2中,构建了重组质粒pEASY-En;用DNA双链测序法测定重组质粒pEASY-En中的外源基因序列,证明PCR扩增的产物是PuGV转宿主病毒PuGV-Ps增效蛋白的全长基因。与原始PuGV基因组增效蛋白的序列比较,两者同源性达99.59%,其中5’端500 nt相似性为98.60%,而3’端500 nt仅1个碱基发生突变。说明PuGV-Ps增效蛋白基因的3’端是基因的保守区域。8原核表达了PuGV-Ps增效蛋白并测定了表达蛋白的增效活性以大肠杆菌BL21（DE3）为感受态细胞,将插入PuGV-Ps增效蛋白基因的重组质粒pEASY-En转化到大肠杆菌中,构建了重组菌,于37℃下通过IPTG诱导表达了108 kD的表达产物。表达的目的蛋白带有6×His标签,能特异性吸附在Ni2+上并得到纯化,证明表达产物是目标增效蛋白。LB培养液中加入0.2%的葡萄糖后有利于增效蛋白基因的表达。生物测定结果表明,粗提的表达产物具有增效活性,可以提高Bt对棉铃虫、甜菜夜蛾的敏感性,600μg/g Bt浓度中加入300μg/g增效蛋白表达产物后甜菜夜蛾死亡率提高了10%,400μg/g Bt浓度中加入400μg/g增效蛋白表达产物后,棉铃虫死亡率由23.67%提高至38.67%,差异显着。随表达产物量的增加,增效作用更为显着。9研制了PuGV-Ps增强Bt制剂,并明确了其应用效果依据PuGV-Ps对Bt的增效作用,采用人工增PuGV-Ps、液体发酵Bt和喷雾干燥加工技术,研制了一种病毒增强Bt可湿性粉剂。该制剂主要成份为PuGV-Ps和Bt,含量为3.0×109OB/g PuGV-Ps·1.0×1010活芽孢/g Bt,共毒系数达162.57。该制剂毒性微毒,大白鼠经口LD50大于5000 mg/kg,无致敏和刺激性,无致病性,对鱼、鸟和蜜蜂均为低毒。田间应用结果表明,对小菜蛾、甜菜夜蛾、水稻纵卷叶螟Canphalocrocis medinalis等多种害虫都有较好防效。2000μg/mL浓度对小菜蛾2 d、7 d的防效达86.74%和79%,较Bt单剂的防效分别提高了23.5%和29.7%,差异显着;对甜菜夜蛾10 d防效达61.22%,与阿维菌素（Abamectin）1000μg/mL防效相当;水稻田使用病毒增强Bt 1500 g/ha对稻纵卷叶螟7 d防效达80.77%,高于Bt单剂71.15%的防效;使用病毒增强Bt对稻田蜘蛛无影响,药后7 d田间蜘蛛减少率为3.92%,而阿维菌素等对蜘蛛杀伤率达34.39%。
姜立珍[7]（2007）在《雪花莲凝集素基因遗传转化甘蔗的研究》文中进行了进一步梳理甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我国重要的糖料作物,还是一种重要的能源作物。蔗螟和绵蚜是甘蔗的重要害虫,它们不但造成甘蔗产量损失、蔗糖含量的下降,还传播多种甘蔗病毒,传病造成的损失比直接为害造成的损失更为严重。利用植物基因工程技术把抗虫基因导入优良甘蔗品种中使其得到有效的表达从而表现出抗虫性是培育甘蔗抗虫品种最有效的途径。雪花莲凝集素（GNA）是目前与害虫治理有关且研究得比较多的一种单子叶植物甘露糖结合凝集素,能结合到昆虫消化道上皮细胞糖蛋白受体上,对昆虫产生局部或系统毒害后果,抑制害虫生长发育繁殖。因此把GNA基因转入高产高糖甘蔗品种中使其得到有效的表达,以有效提高甘蔗的抗虫性。本研究构建了rbcs启动子驱动的雪花莲凝集素基因的植物表达载体prG,然后利用“冻融法”导入超毒性农杆菌菌株EHA105中,再通过农杆菌介导法对甘蔗进行遗传转化,经过PPT抗性筛选,获得抗性植株53株,对其中的10株进行PCR检测,有2株呈阳性,初步证明雪花莲凝集素基因已整合到甘蔗的基因组中。
张广林[8]（2007）在《稻纵卷叶螟对Bt水稻抗性风险及其对策初步研究》文中研究说明本论文就稻纵卷叶螟对Bt水稻抗性风险及其对策进行了初步的研究与探讨，结果如下：1稻纵卷叶螟对CrylAb杀虫蛋白及其转基因水稻的的敏感性采用浸叶喂毒法测定了稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis（Guenée）不同地区种群对CrylAb的敏感性。CrylAb蛋白对稻纵卷叶螟不同地区种群的LC50范围从20.00ng／cm2（浙江杭州）到69.60ng／cm2（浙江宁波）。应用多剂量LD-p线获得了稻纵卷叶螟田间种群对CrylAb的诊断剂量，为620ng／cm2。采用单雌系分析法测定稻纵卷叶螟种群对CrylAb蛋白和Bt水稻的敏感性频率分布。2水稻螟虫对4种Bt杀虫蛋白的敏感性测定采用人工饲料喂毒法和浸叶喂毒法测定了二化螟Chilo suppressalis（Walker）、大螟Sesamia inferens（Walker）和稻纵卷叶螟初孵幼虫对4种Bt杀虫蛋白的敏感性。二化螟对CrylAb、CrylAc、CrylC和Cry2A的LC50值分别为1.739ng／mg、2.645ng／mg、2.794ng／mg和15.965ng／mg；大螟依次为2.455ng／mg、10.046ng／mg、11.803ng／mg和35.359ng／mg；稻纵卷叶螟依次为4.000μg／ml、1.611μg／ml、69.031μg／ml和12.708μ／ml。3基于cry基因的新型融合基因构建通过分子生物学技术，构建含Cry蛋白结构域Ⅱ序列和抗菌活性肽（AMPs）序列融合基因的质粒载体，其表达产物的杀虫活性还有待于进一步验证。这为筛选新型杀虫候选基因用于转基因抗虫作物培育提供了新思路。
邓智年[9]（2007）在《野苋菜凝集素基因的克隆及转基因研究》文中研究指明蚜虫属同翅目昆虫，种类繁多，侵害目标广泛。它通过口器深入植物的韧皮部吸收营养，并携带和传播病毒，造成农作物的产量和品质的下降。植物抗虫基因工程为控制害虫的危害提供了新的途径。随着越来越多的抗虫基因被导入植物以提高植物的抗虫能力，人们发现：寻找新的高效抗虫基因，仍是现阶段抗虫基因工程的关键；对植物抗虫能力的提高不能单单依靠某个抗虫基因的转入就能实现；抗虫基因在转基因植物体内表达不稳定甚至出现转基因沉默；等等。基因融合可以使多个抗虫基因协同作用，提高植物的抗虫能力和抗虫谱并实现基因同步表达，并以完全独立的不同的杀虫蛋白的形式发挥活性，因此在植物抗虫基因工程中有很高的利用价值。此外，利用MARs序列（Matrix attachment regios，MARs）是在染色体水平克服外源基因失活的一种有效策略。本研究采用同源扩增PCR技术，从苋属的野苋菜中分离和克隆新的苋菜凝集素家族基因，并对这个基因的结构与功能进行研究，阐明在现代分子遗传育种中引入该基因的可能途径和重要意义。通过构建杀虫融合蛋白基因，即将两个抗虫基因编码序列通过接头连接在一起，构成可同时表达两种抗虫活性的融合蛋白，以期能延缓昆虫抗性的发生，而且也增强了杀虫活性。另外，在减少基因沉默的措施上，在目的基因的两侧增加基质结合序列（MARs），以增强基因的表达能力。本研究取得的主要结果如下：1．利用同源克隆的方法从野苋菜Amaranthus viridis L．中克隆到野苋菜凝集素基因（Amaranthus viridis aggllutinin，AVA）。转基因烟草植株的抗蚜分析表明，表达野苋莱凝集素的转基因烟草植株都不同程度地抑制了蚜虫群体发展的速度，转AVA和AVAc基因植株平均抑蚜率分别约为60.181％和50.63％。转含有内含子的AVA基因比不含内含子的编码区基因AVAc有更好的抗蚜性。AVA基因是苋菜凝集素基因家族的新成员，是一个有应用前景的新的抗虫基因。2．本研究从三个不同品种的豌豆中分离到3个具有MARs序列特征的DNA片段MMAR．DMAR，HMAR。利用GenBank同源性搜寻发现它们是新的未注册的DNA序列。经转化烟草对GUS活性测定发现，两侧顺式重复连接MAR对外源基因表达的增强作用很明显，MMAR、HMAR和DMAR都不同程度的提高了GUS的表达，分别为载体对照植株的4.16、3.66和2.08倍。但不同个体间表达水平差异仍然比较明显。3．通过构建MAR-AVA-MAR植物表达载体，利用农杆菌介导法转化白菜，获得抗蚜转化植株。含有AVA基因的白菜植株对桃蚜的群体发展有一定的抑制作用，在接种12天后的平均抑制桃蚜密度达55.8％；在转基因抗性植株上观察到有少量桃蚜若虫死亡的现象。无MAR的转基因植株平均桃蚜抑制率为34.3％。但含MAR的转基因单株之间基因表达也仍存在一定的差异。从总体上来说含有MAR的转基因白菜植株较不含MAR的转化植株对桃蚜具有更明显的抑制作用，且抗性程度与AVA基因的表达量呈正相关。4．根据豇豆胰蛋白酶抑制剂CpTl和野苋菜凝集素AVAc的抗虫特性，利用豌豆MMAR，成功构建了pC2MAR-AVAc／CpTI植物表达载体。以甘蔗ROC25胚性愈伤组织为转化受体材料，建立了一个高效而又简便的农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系，成功地实现了MAR序列介导杀虫融合基因（AVAc+CpTI）在甘蔗中转化。
冯学[10]（2007）在《苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究》文中提出每年，农业虫害在全球范围内对农作物造成的损害，是农作物减产的最主要因素之一。由于苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringensis）对大多数农业害虫都具有特异的杀虫活性，并且，对人畜安全，不污染环境。目前，已成为世界上产量最多、应用最广泛的微生物杀虫剂。特别是，随着植物基因工程的发展，利用转基因植物来防治害虫已经进入到实际运用阶段，其中，在抗虫转基因植物方面，Bt杀虫基因得到了最为普遍的应用。本研究在克隆新的cry基因的基础上，用Cry2Ab、Cry2Aa、Cry1Ca、Vip3Da或Vip3Af杀虫蛋白对水稻二化螟、大螟的杀虫活性进行了生物活性分析；改良了培养Bt菌株的传统牛肉膏蛋白胨培养基。1．本文从实验室自行分离的C006菌株中，经PCR扩增鉴定、酶切分析和构建质粒DNA文库的方法，获得了含有10kb阳性片段转化子，对其进行亚克隆，经测序分析发现该片段含有2种cry基因，其中一个是新的cry1类基因，与己知的cryl类基因的同源性低于80％，并在GeneBank中登记，序列注册号为EF550989。另一个基因核苷酸序列与cry1Ab13一致。2．将crylGb2全长基因分别插入Bt和E coli表达载体，在大肠杆菌BL21和苏云金芽胞杆菌HD73-中分别表达出133kDa的Cry蛋白，并且在Bt无晶体突变株中能形成典型的双锥体型晶体。这种新蛋白对小菜蛾进行生物活性测定，具有很强的毒力，LC50为7.48μg／mL。3．针对水稻重要鳞翅目害虫二化螟和大螟，从本组已有的基因中选用15种，分别进行单一蛋白杀虫活性筛选，结果表明对水稻二化螟幼虫具有活性的Cry2Aa、Cry2Ab、Vip3Da蛋白，它们的致死中浓度LC50分别为：27.59、13.88和10.29μg／g；毒蛋白组合Cry1Ab与Cry2Aa、Cry1Ab与Cry2Ab、Cry1Ab与Vip3Da、Cry1Ca与Cry2Aa、Cry1Ca与Cry2Ab、Cry1Ca与Vip3Da对二化螟LC50分别为：0.39、0.43、0.15、0.79、0.64和3.39μg／g，不同毒蛋白的协同增效作用显着。4．对夜蛾科害虫大螟的杀虫结果表明：Cry1Ca对水稻大螟具有较显着的活性，Cry1Ca对水稻大螟的LC50为4.28μg／g，Vip3Aa为16.64μg／g，Vip3Af为57.54μg／g，Vip3Da为13.93μg／g。5．对几种不同的Bt培养基进行优化，获得了最佳的配方：含有50mMTris-HCl、pH为7.2的牛肉膏蛋白胨培养基，能获得最大产量的蛋白晶体，该培养基稳定的缓冲能力，减少了晶体在培养过程中的溶解，有效地抑制了Bt菌株内源蛋白酶对晶体蛋白的降解。6．对造成中国林木严重危害的黄斑星天牛的饲养与生物测定方法进行了筛选和探索，建立了饲养和生测方法：同时也筛选到两株对天牛有毒杀活性的菌株，这将为以后对天牛具有杀虫活性的Bt基因的筛选奠定基础。
二、转苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因抗虫水稻的GUS和PCR辅助选择（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因抗虫水稻的GUS和PCR辅助选择（论文提纲范文）
（1）转Bt-pta基因水稻后代分子检测与抗虫性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词与英汉对照 |
| 第一章 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 双价转基因水稻的研究进展 |
| 1.1.1 Pta基因及转pta基因抗虫水稻的作用机理 |
| 1.1.2 Bt基因及转Bt基因抗虫水稻的作用机理 |
| 1.1.3 转基因抗虫水稻的安全性 |
| 1.1.4 转基因水稻研究的展望 |
| 1.2 转基因植株的检测 |
| 2 本研究的目的、意义以及主要研究内容 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 研究的主要内容 |
| 第二章 T_0代转基因水稻植株的转化及初步筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试水稻品种 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂及引物 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 引物 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要溶液配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 双价载体pCAMBIA1301-Bt-pta的构建 |
| 2.2 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 2.3 转基因水稻再生植株炼苗及移栽 |
| 2.4 转Bt-pta水稻再生植株检测 |
| 2.4.1 GUS检测 |
| 2.4.2 转Bt-pta水稻再生植株基因组DNA提取 |
| 2.4.3 阳性对照质粒提取 |
| 2.4.4 转Bt-pta基因再生植株的PCR检测 |
| 2.4.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta的构建 |
| 3.2 再生植株的获得 |
| 3.3 转Bt-pta基因水稻再生植株鉴定 |
| 3.3.1 GUS组织化学染色分析 |
| 3.3.2 转基因植株的PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于双价转基因抗虫水稻的获得 |
| 4.2 关于双价转基因抗虫水稻的抗虫性鉴定 |
| 第三章 T_1代和T_2代转基因水稻的分子检测及抗虫性鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 水稻材料 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 主要试剂及引物 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 引物 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要试剂配方 |
| 1.6 供试昆虫 |
| 2 方法 |
| 2.1 T_1代转基因水稻的分子检测 |
| 2.1.1 T_1代转基因水稻的GUS检测 |
| 2.1.2 T_1代转基因水稻的PCR检测 |
| 2.1.3 T_1代转基因水稻中Bt毒蛋白的含量与其抗虫性的关系 |
| 2.2 T_1代转基因水稻抗虫性鉴定 |
| 2.2.1 T_1代转基因水稻抗虫性室内鉴定 |
| 2.2.2 T_1代转基因水稻抗虫性田间鉴定 |
| 2.2.3 田间自然发虫的调查 |
| 2.3 T_1代转基因水稻主要农艺性状的考察 |
| 2.4 T_2代转基因水稻的分子检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 T_1转基因水稻的分子检测 |
| 3.1.1 转基因水稻的GUS检测 |
| 3.1.2 T_1代转基因水稻的PCR检测 |
| 3.2 T_1代转基因水稻中Bt毒蛋白的含量与其抗虫性的关系 |
| 3.2.1 T_1代转基因水稻Cry1C蛋白ELISA检测标准曲线绘制 |
| 3.2.2 T_1代转基因水稻Cry1C蛋白ELISA检测 |
| 3.3 T_1代转基因水稻的抗虫性鉴定 |
| 3.3.1 T_1代转基因水稻的室内抗虫性鉴定 |
| 3.3.2 T_1代转基因水稻的田间抗虫性鉴定 |
| 3.3.3 T_1代转基因水稻的田间自然发虫调查 |
| 3.4 T_1代转基因水稻的农艺性状的考察 |
| 3.5 T_2代转基因水稻的分子检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于高抗性、稳定遗传的双价转基因水稻的获得 |
| 4.2 关于双价转基因水稻农艺性状的改变 |
| 第四章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
（2）大豆子叶节遗传转化体系优化及转Cry1Iem基因抗虫新材料的获得（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 抗虫基因工程的研究 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌基因 |
| 1.2 其他抗虫基因及其转基因植物 |
| 1.3 大豆抗虫性鉴定研究 |
| 第二章 大豆遗传转化体系的研究进展 |
| 2.1 大豆组织培养与再生体系 |
| 2.2 大豆遗传转化技术研究进展 |
| 第三章 大豆遗传转化技术中存在的障碍及解决途径 |
| 第四章 论文的研究目的及意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 大豆子叶节再生体系优化研究及抗虫基因的转化 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 第二章 结果与分析 |
| 2.1 质粒的鉴定 |
| 2.2 抗氧化剂对大豆子叶节丛生芽诱导率的影响 |
| 2.3 农杆菌浓度及菌株对大豆子叶节再生体系的影响 |
| 2.4 表面活性剂对转化率的影响 |
| 2.5 共培养时间对农杆菌介导大豆子叶节GUS瞬时表达的影响 |
| 2.6 Cry1Iem转化植株的鉴定 |
| 2.7 转化植株抗虫性鉴定 |
| 第三章 讨论 |
| 1 农杆菌介导的大豆子叶节再生体系的优化 |
| 2 农杆菌介导抗虫基因Cry1Iem抗虫新材料的获得 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）苏云金杆菌嵌合杀虫蛋白的构建与毒性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 |
| 1.2.1 杀虫晶体蛋白命名与分类 |
| 1.2.2 Cry类杀虫晶体蛋白性质 |
| 1.2.3 Cry杀虫晶体蛋白结构 |
| 1.2.4 杀虫晶体蛋白毒性机理 |
| 1.2.5 昆虫抗性与杀虫晶体蛋白受体之间关系 |
| 1.2.6 杀虫晶体蛋白Cry9Ca1性质 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白 |
| 1.3.1 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白分类 |
| 1.3.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Vip3A结构与性质 |
| 1.3.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Vip3A毒性机理 |
| 1.3.4 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa7性质 |
| 1.4 融合杀虫蛋白 |
| 1.4.1 多价杀虫蛋白的日的与优势 |
| 1.4.2 双价杀虫基因在转基因领域的应用方式 |
| 1.4.3 目前发明的抗虫多价融合蛋白 |
| 1.5 苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白毒力与溶解度的关系 |
| 1.5.1 杀虫晶体蛋白毒力与溶解度关系 |
| 1.5.2 营养期杀虫蛋白Vip3A毒力与溶解度关系 |
| 1.6 转基因抗虫植物 |
| 1.6.1 转基因是防治虫害的发展趋势 |
| 1.6.2 当前我国转基因研究实例 |
| 1.7 研究目的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 引物序列 |
| 2.1.3 培养基,抗生素及其培养条件 |
| 2.1.4 试剂与器材 |
| 2.1.5 供试昆虫 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 常规DNA操作 |
| 2.2.2 定点突变 |
| 2.2.3 蛋白异源表达,蛋白酶消化,SDS-PAGE及蛋白定量 |
| 2.2.4 异源表达杀虫蛋白包涵体的显微镜观察 |
| 2.2.5 杀虫蛋白毒力的生物测定 |
| 2.2.6 杀虫蛋白半致死浓度LC_(50)和协同系数的计算 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 单双价杀虫蛋白植物表达载体的构建 |
| 3.1.1 pCPANV3AC2A双价嵌合植物表达载体构建 |
| 3.1.2 pCPANV3AC1C双价植物表达载体的构建 |
| 3.1.3 pCPANC1C,pCPANC2A单价植物表达载体的构建 |
| 3.1.4 pCPANEK通用植物表达载体的构建 |
| 3.1.5 pCPANEK通用植物表达载体特点和使用 |
| 3.2 单价,双价融合蛋白的构建,异源表达以及毒力分析 |
| 3.2.1 Cry1Ca,Cry2Aa,Cry9Ca,Vip3Aa7单价蛋白大肠杆菌原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 V3AC1C,V3AC2A,V3AC9C双价嵌合蛋白大肠杆菌原核表达载体的构建 |
| 3.2.3 单双价蛋白的表达 |
| 3.2.4 杀虫蛋白异源表达包涵体的镜检 |
| 3.2.5 杀虫蛋白的胰蛋白酶消化 |
| 3.2.6 生物测定各杀虫蛋白毒力 |
| 3.3 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa7半胱氨酸突变体的毒力变化分析 |
| 3.3.1 Vip3Aa7蛋白的生物信息学分析 |
| 3.3.2 Vip3Aa7半胱氨酸残基定点突变及突变体的载体构建 |
| 3.3.3 Vip3Aa7半胱氨酸突变体蛋白的表达与溶解度分析 |
| 3.3.4 Vip3Aa7半胱氨酸突变体蛋白毒力的生物测定 |
| 3.3.5 胰蛋白酶对Vip3Aa7半胱氨酸突变体蛋白的消化测定 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 嵌合蛋白构建方式的研究和定点突变 |
| 4.2 嵌合蛋白构建植物表达载体相对于传统双价载体的优势 |
| 4.3 嵌合蛋白被胰蛋白酶消化的研究 |
| 4.4 嵌合蛋白高毒力的分析 |
| 4.5 突变半胱氨酸对改造苏云金芽胞杆菌毒力的探讨 |
| 参考文献 |
| 已发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
（4）塔形毛白杨CV-BJHR01再生体系的建立及Bt抗虫基因工程的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 Bt抗虫基因 |
| 1.1.2 植物遗传转化方法 |
| 1.1.3 Bt抗虫基因转化杨树的研究进展 |
| 1.1.4 展望 |
| 1.1.5 本研究的立题依据和技术路线 |
| 2 塔形毛白杨CV-BJHR01再生体系的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 植物培养试剂 |
| 2.2.3 培养设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 无菌材料的获得 |
| 2.3.2 外植体的分化、伸长以及生根培养 |
| 2.3.3 炼苗及移栽 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 塔形毛白杨CV-BJHR01遗传转化系统的验证和优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 菌株与载体 |
| 3.2.3 试剂盒和生化试剂 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 GUS染色所需的溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 碱法小量提取质粒DNA |
| 3.3.2 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 3.3.3 热击转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.3.4 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.3.5 电击法转化农杆菌感受态细胞 |
| 3.3.6 农杆菌C58介导的gus基因的转化及GUS染色 |
| 3.3.7 杨树外植体材料的Kan浓度梯度筛选 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 塔形毛白杨CV-BJHR01遗传转化系统的验证 |
| 3.4.2 对塔形毛白杨CV-BJHR01卡那霉素抗性研究 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 抗虫转基因塔形毛白杨的获得 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌株与载体 |
| 4.2.3 试剂盒和生化试剂 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 提取杨树DNA溶液的配制 |
| 4.2.6 PCR-Southern所需要的溶液配制 |
| 4.2.7 mBt-Cry3A ImmunoStrip Test缓冲液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 质粒DNA的提取 |
| 4.3.2 酶切验证载体pBin438-Mcry3 |
| 4.3.3 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 4.3.4 电击法转化农杆菌感受态细胞 |
| 4.3.5 农杆菌C58介导的mBt886cry3Aa抗虫基因的转化 |
| 4.3.6 再生植株的PCR检测 |
| 4.3.7 PCR-Southem杂交 |
| 4.3.8 mBt-Cry3A ImmunoStrip检测 |
| 4.3.9 mBt-Cry3A ELISA Kit检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 双酶切验证载体pBin438-Mcry3 |
| 4.4.2 PCR检测阳性植株 |
| 4.4.3 PCR-Southem杂交检测阳性植株 |
| 4.4.4 mBt-Cry3A ImmunoStrip检测 |
| 4.4.5 mBt-Cry3A ELISA Kit检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）抗虫基因植物表达载体构建、遗传转化及表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌基因 |
| 1.1.1 Bt 毒蛋白杀虫机理 |
| 1.1.2 Bt 毒蛋白的分类 |
| 1.2 转Bt 基因植物研究 |
| 1.3 影响Bt 基因在转基因植物中表达的因素 |
| 1.3.1 表达单元及辅助因子 |
| 1.3.2 植物发育 |
| 1.3.3 外部环境条件 |
| 1.3.4 受体植物的遗传背景 |
| 1.3.5 Bt 基因在受体细胞染色体上的插入位点 |
| 1.3.6 转基因植物中Bt 基因的沉默 |
| 1.4 解决害虫对转Bt 基因作物产生抗性的策略 |
| 1.4.1 选择启动子 |
| 1.4.2 同时使用两种以上的Bt 基因转化 |
| 1.4.3 联合使用Bt 基因和其它类型的抗虫基因 |
| 1.5 获得多价转基因植物策略 |
| 1.6 杨树Bt 抗虫基因工程的研究 |
| 1.6.1 国外杨树Bt 抗虫基因工程研究进展 |
| 1.6.2 国内杨树Bt 抗虫基因工程研究进展 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 植物表达载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 酶及生化试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 常用培养基和试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 pCAMBIA3301-Bt1 表达载体的构建 |
| 2.2.2 pCAMBIA3301-Bt3 表达载体的构建 |
| 2.2.3 pCAMBIA3301-Bt1-Bt3 表达载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 质粒pCAMBIA1305-Bt1 的PCR 检测结果 |
| 2.3.2 pCAMBIA3301-Bt1 阳性克隆的酶切及PCR 鉴定 |
| 2.3.3 质粒pCAMBIA1305-Bt3 的PCR 检测结果 |
| 2.3.4 pCAMBIA3301-Bt3 阳性克隆的酶切及PCR 鉴定 |
| 2.3.5 质粒 pCAMBIA1305-Bt1-Bt3 的酶切及 PCR 检测 |
| 2.3.6 pCAMBIA3301-Bt1-Bt3 阳性克隆鉴定 |
| 3 烟草遗传转化及转化植株的检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 抗生素 |
| 3.1.5 重要试剂、酶和试剂盒 |
| 3.1.6 重要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 选择压浓度的确定 |
| 3.2.2 抑菌抗生素浓度的确定 |
| 3.2.3 菌株培养及菌液制备 |
| 3.2.4 农杆菌介导的基因转化 |
| 3.2.5 转基因烟草的抗性鉴定 |
| 3.2.6 转基因烟草的DNA 水平检测 |
| 3.2.7 转基因烟草的蛋白质水平检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 潮酶素(Hyg)对烟草叶片分化的影响 |
| 3.3.2 潮酶素(Hyg)对嫩茎生根的影响 |
| 3.3.3 头孢噻肟钠(CTX)对叶片分化的影响 |
| 3.3.4 头孢噻肟钠(CTX)对农杆菌的抑制能力 |
| 3.3.5 遗传转化单、双价Bt 基因转基因烟草的获得 |
| 3.3.6 转化植株抗性鉴定 |
| 3.3.7 转基因烟草植株的PCR 鉴定 |
| 3.3.8 转基因烟草Bt 毒蛋白的ELISA 检测 |
| 4 741 杨遗传转化及转化植株的检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌种和质粒 |
| 4.1.3 培养基 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 叶片再生体系的确立 |
| 4.2.2 选择压浓度的确定 |
| 4.2.3 抑菌抗生素浓度的确定 |
| 4.2.4 农杆菌介导的741 杨遗传转化体系的优化 |
| 4.2.5 农杆菌介导法转化741 杨 |
| 4.2.6 转基因植株的抗性鉴定 |
| 4.2.7 转基因植株的PCR 检测 |
| 4.2.8 转基因植株Bt 毒蛋白的ELISA 检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 741 杨叶片再生体系的确立 |
| 4.3.2 潮霉素(Hyg)对叶片分化的影响 |
| 4.3.3 潮霉素(Hyg)对嫩茎生根的影响 |
| 4.3.4 头孢噻肟钠(CTX)对叶片分化的影响 |
| 4.3.5 头孢噻肟钠(CTX)抑菌浓度的确定 |
| 4.3.6 影响农杆菌转化效率因素的优化 |
| 4.3.7 转双 Bt 基因741 杨的筛选及获得 |
| 4.3.8 转基因植株的抗性鉴定 |
| 4.3.9 转基因植株的PCR 检测 |
| 4.3.10 转基因植株Bt 毒蛋白的ELISA 检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 植物表达载体构建 |
| 5.2 标记基因的选择 |
| 5.3 Bt 毒蛋白表达的分析 |
| 5.4 转双Bt 基因741 杨的获得 |
| 5.5 转Bt 抗虫基因植物潜在的生态风险性 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌增效作用及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照词 |
| 第1章 研究背景和思路 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 苏云金杆菌的杀虫作用 |
| 1.2.1 苏云金杆菌的致病因子 |
| 1.2.2 δ-内毒素的作用机理 |
| 1.3 苏云金杆菌的增效途径 |
| 1.3.1 苏云金杆菌杀虫毒素间的增效作用 |
| 1.3.2 苏云金杆菌与其他病原微生物的增效作用 |
| 1.3.3 苏云金杆菌与化学农药间的增效作用 |
| 1.3.4 苏云金杆菌与化学添加剂和植物次生物质的增效作用 |
| 1.4 昆虫杆状病毒的增效作用 |
| 1.4.1 杆状病毒的增效作用及增效蛋白 |
| 1.4.2 增效蛋白的性质 |
| 1.4.3 增效蛋白的基因定位、测序和克隆 |
| 1.4.4 增效蛋白的作用机理 |
| 1.5 存在的问题和本研究的目的意义 |
| 1.6 研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 1.6.3 主要研究方法 |
| 参考文献 |
| 第2章 PuGV-Ps 对Bt 的增效作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PuGV-Ps 和 Bt 对不同昆虫的增效活性测定 |
| 2.3.2 灭活 PuGV-Ps 对 Bt 毒力的增效作用 |
| 2.3.3 PuGV-Ps 对 Bt 杀虫速度的影响 |
| 2.3.4 PuGV-Ps 对转 Bt 抗虫棉的增效作用 |
| 2.3.5 PuGV-Ps 与 Bt 共同作用对甜菜夜蛾幼虫生长发育的抑制作用 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 PuGV-Ps 增效蛋白的纯化及对Bt 增效作用测定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PuGV-Ps 的转主增殖及病毒形态 |
| 3.3.2 PuGV-Ps 增效蛋白的SDS-PAGE 电泳结果 |
| 3.3.3 凝胶柱层析分离纯化 PuGV-Ps 增效蛋白 |
| 3.3.4 分离纯化增效蛋白的增效活性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 PuGV-Ps 对Bt 的增效作用的影响因子 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PuGV-Ps 与 Bt 不同配比的增效作用 |
| 4.3.2 不同温度、pH 对PuGV-Ps 提高Bt 毒力的影响 |
| 4.3.3 PuGV-Ps 与 Bt 对不同龄期小菜蛾幼虫的增效作用 |
| 4.3.4 PuGV-Ps 取食时间对 Bt 毒力的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第5章 PuGV-Ps 对苏云金杆菌δ-内毒素的酶解活化作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PuGV-Ps 的蛋白酶活性检测 |
| 5.3.2 PuGV-Ps 对δ-内毒素的酶解活化作用测定 |
| 5.3.3 不同碱解时间和 pH 对 PuGV 酶解活化 δ-内毒素的影响 |
| 5.3.4 蛋白酶抑制剂对 PuGV-Ps 酶解作用的抑制作用 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第6章 PuGV-Ps 对甜菜夜蛾中肠液过度降解δ-内毒素的抑制作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PuGV-Ps 对甜菜夜蛾中肠酶活性的抑制作用 |
| 6.3.2 PuGV-Ps 抑制中肠酶液过度降解 δ-内毒素的测定 |
| 6.3.3 不同温度和 pH 条件下 PuGV-Ps 抑制中肠液过度降解δ-内毒素作用 |
| 6.3.4 甜菜夜蛾中肠液在不同缓冲液降解δ-内毒素的变化 |
| 6.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第7章 PuGV-Ps 和Bt 对甜菜夜蛾中肠围食膜的破坏作用 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 试验材料 |
| 7.2.2 试验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 PuGV-Ps 和 Bt 破坏甜菜夜蛾围食膜外壁的电镜观察 |
| 7.3.2 PuGV-Ps 和Bt 破坏甜菜夜蛾围食膜内壁电镜观察 |
| 7.3.3 PuGV-Ps 及Bt 对甜菜夜蛾围食膜蛋白的降解作用 |
| 7.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第8章 PuGV-Ps 增效蛋白基因的克隆和测序 |
| 8.1 前言 |
| 8.2 材料与方法 |
| 8.2.1 试验材料 |
| 8.2.2 试验方法 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 PuGV-Ps 增效蛋白基因的PCR 扩增 |
| 8.3.2 PuGV-Ps 增效蛋白基因PCR 产物的克隆及鉴定 |
| 8.3.3 增效蛋白基因重组质粒pEASY-En 的序列测定 |
| 8.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第9章 PuGV-Ps 增效蛋白的表达和活性测定 |
| 9.1 前言 |
| 9.2 材料和方法 |
| 9.2.1 试验材料 |
| 9.2.2 试验方法 |
| 9.3 结果和分析 |
| 9.3.1 重组增效蛋白表达质粒的转化和检测 |
| 9.3.2 重组增效蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 鉴定 |
| 9.3.3 重组增效蛋白表达产物的粗提和纯化 |
| 9.3.4 重组增效蛋白基因表达产物对 Bt 的增效活性测定 |
| 9.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第10章 PuGV-Ps 增强Bt 制剂的研制和应用效果 |
| 10.1 前言 |
| 10.2 材料与方法 |
| 10.2.1 试验材料 |
| 10.2.2 试验方法 |
| 10.3 结果与分析 |
| 10.3.1 病毒增强 Bt 的研制 |
| 10.3.2 病毒增强 Bt 的田间应用效果 |
| 10.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第11章 结语 |
| 11.1 本研究的主要结论 |
| 11.1.1 PuGV-Ps 对 Bt 的增效作用及其影响因子 |
| 11.1.2 PuGV-Ps 对 Bt 的增效作用机理 |
| 11.1.3 PuGV-Ps 增强 Bt 制剂的研制和应用 |
| 11.2 本研究的创新点 |
| 11.3 进一步研究的建议 |
| 11.3.1 PuGV-Ps 增效作用的调控途径 |
| 11.3.2 PuGV-Ps 对 Bt 抗性治理的作用 |
| 11.3.3 杆状病毒和 Bt 增效作用的研究 |
| 11.3.4 昆虫病毒和 Bt 增效作用的评价标准 |
| 攻读学位期间发表的论文及科研工作 |
| 致谢 |
（7）雪花莲凝集素基因遗传转化甘蔗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物抗虫基因工程研究进展 |
| 1.1.1 雪花莲凝集素基因的研究进展 |
| 1.1.2 bt 基因的研究进展 |
| 1.1.3 蛋白酶抑制剂基因的研究进展 |
| 1.1.4 淀粉酶抑制剂基因的研究进展 |
| 1.1.5 胆固醇氧化酶基因 |
| 1.1.6 营养杀虫蛋白基因 |
| 1.1.7 系统肽基因 |
| 1.1.8 昆虫毒素抗虫基因 |
| 1.1.9 其他抗虫基因 |
| 1.1.10 非蛋白质类杀虫剂调控基因 |
| 1.1.11 抗虫基因工程中存在的问题、解决途径及展望 |
| 1.2 甘蔗遗传转化研究进展 |
| 1.2.1 甘蔗的遗传转化方法 |
| 1.2.2 甘蔗的遗传转化现状 |
| 1.3 本研究的目的意义、内容及技术路线 |
| 1.3.1 研究的目的意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 质粒和菌种 |
| 2.1.2 试剂和药品 |
| 2.2 植物表达载体的构建 |
| 2.2.1 构建策略 |
| 2.2.2 GNA 基因的验证 |
| 2.2.3 pr-GUS 中间表达载体的构建 |
| 2.2.4 prG 载体的构建 |
| 2.2.5 prG 植物表达载体转化农杆菌 |
| 2.3 RBCS 驱动下的GNA 基因遗传转化甘蔗 |
| 2.3.1 甘蔗转化材料及农杆菌菌液的准备 |
| 2.3.2 农杆菌菌液浸染愈伤组织及共培养 |
| 2.3.3 筛选培养 |
| 2.3.4 转化植株的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 植物表达载体的构建 |
| 3.1.1 GNA 基因的验证 |
| 3.1.2 pr-GUS 中间表达载体的构建 |
| 3.1.3 prG 植物表达载体的构建 |
| 3.2 PRG 植物表达载体转化农杆菌 |
| 3.3 农杆菌介导的甘蔗转化 |
| 3.3.1 农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织 |
| 3.3.2 农杆菌侵染后的愈伤组织分化成苗 |
| 3.3.3 小植株的抗性筛选 |
| 3.3.4 转化和筛选的程序 |
| 3.4 遗传转化植株的PCR 检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转基因甘蔗发展前景 |
| 4.2 关于RBCS 启动子 |
| 4.3 关于GNA 基因 |
| 4.4 关于多基因联用的策略 |
| 5 结论 |
| 6 本研究的后续工作 |
| 参考文献 |
| 缩写词（ABBREVIATION） |
| 致 谢 |
（8）稻纵卷叶螟对Bt水稻抗性风险及其对策初步研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 抗虫作物的抗虫基因资源 |
| 1.1 蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitors,PI)与GMO |
| 1.2 Bt杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)与GMO |
| 1.3 Bt营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,VIPs)与GMO |
| 1.4 外源凝集素(Lectin)与GMO |
| 1.5 淀粉酶抑制剂(α-Amylase Inhibitors,α AI)与GMO |
| 1.6 动物来源的抗虫基因与GMO |
| 2 转基因抗虫作物培育 |
| 3 抗性产生的研究进展 |
| 3.1 抗性产生的机理 |
| 3.2 抗性的监测 |
| 3.3 抗性的治理措施 |
| 第二章 稻纵卷叶螟对CrylAb蛋白及其转基因水稻的敏感性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 供试水稻 |
| 1.3 浸叶生物测定法 |
| 1.4 稻纵卷叶螟对Bt杀虫蛋白敏感性测定 |
| 1.5 稻纵卷叶螟对Bt水稻敏感性测定 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 稻纵卷叶螟对CrylAb敏感性的诊断剂量 |
| 2.2 稻纵卷叶螟对CrylAb蛋白敏感性的种群结构分析 |
| 2.3 稻纵卷叶螟对Bt水稻敏感性的种群结构分析 |
| 2.4 稻纵卷叶螟不同地区种群对CrylAb蛋白的敏感性 |
| 3 讨论 |
| 第三章 水稻螟虫对4种Bt杀虫蛋白的敏感性测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 生物测定 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 基于cry基因的新型融基因构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 总讨论 |
| 1 稻纵卷叶螟对CrylAb蛋白及其转基因水稻的敏感性 |
| 2 水稻螟虫对4种Bt杀虫蛋白的敏感性测定 |
| 3 基于cry基因的新型融合基因构建 |
| 4 本研究的特色与创新点 |
| 5 今后研究的方向 |
| 参考文献 |
（9）野苋菜凝集素基因的克隆及转基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 Bt基因及其应用 |
| 1.3 植物蛋白酶抑制剂基因及其应用 |
| 1.4 植物凝集素及在抗虫基因工程中的应用 |
| 1.4.1 植物凝集素的分类 |
| 1.4.2 植物凝集素具有很高的稳定性 |
| 1.4.3 植物凝集素的抗病虫机理 |
| 1.4.4 已克隆的植物凝集素基因特征 |
| 1.5 作物转基因抗虫育种的现状 |
| 1.5.1 作物转基因抗虫育种中存在的问题 |
| 1.5.2 解决问题的策略 |
| 1.5.3 目前获得转双价抗虫基因植物的主要方法 |
| 1.6 本项目研究的目的意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 培养基及生长条件 |
| 2.2.1 培养基 |
| 2.2.2 生长条件 |
| 2.2.3 菌种保存 |
| 2.3 抗菌素 |
| 2.4 溶液、缓冲液和试剂 |
| 2.5 质粒DNA的制备 |
| 2.5.1 质粒DNA的小量提取 |
| 2.5.2 质粒大量提取 |
| 2.6 质粒纯化 |
| 2.6.1 酚/氯仿抽提 |
| 2.6.2 分光光度法测定DNA浓度 |
| 2.7 电泳 |
| 2.8 DNA酶切 |
| 2.8.1 DNA的限制性内切酶酶切 |
| 2.8.2 酶切DNA片段的CIP处理 |
| 2.9 T4 DNA聚合酶补平 |
| 2.10 DNA片段的分离与回收 |
| 2.11 DNA连接 |
| 2.12 质粒DNA的转化 |
| 2.12.1 用CaCl_2法制备及转化感受态细胞 |
| 2.12.2 转化反应 |
| 2.13 PCR扩增DNA片段 |
| 2.14 质粒DNA转化根癌农杆菌 |
| 2.14.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.14.2 冻融法转化根癌农杆菌 |
| 2.14.3 农杆菌Ti质粒的提取 |
| 2.15 叶盘法转化烟草 |
| 2.15.1 农杆菌的培养 |
| 2.15.2 烟草无菌苗的准备 |
| 2.15.3 转化烟草植株的获得 |
| 2.16 植物DNA的抽提 |
| 2.17 β-葡糖苷酸酶活性检测(β-glucuronidase，GUS) |
| 2.17.1 GUS的PCR检测 |
| 2.17.2 GUS活性的定性检测 |
| 2.17.3 GUS活性的定量检测 |
| 2.18 DIG标记的PCR-Southern Blotting |
| 第三章 野苋菜凝集素基因的克隆 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 野苋菜凝集素基因(AVA)的克隆 |
| 3.1.3 植物表达载体的构建 |
| 3.1.4 AVA基因和AVAc基因对烟草的遗传转化 |
| 3.1.5 转基因植株的检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 野苋菜凝集素AVA核基因的克隆 |
| 3.2.2 AVA基因的序列分析 |
| 3.2.3 AVA基因编码区序列的克隆 |
| 3.2.4 AVAc基因分析 |
| 3.2.5 植物表达载体的构建 |
| 3.2.6 转基因烟草植株的获得及检测 |
| 3.2.7 转基因烟草对蚜虫生长发育的抑制作用 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 豌豆MAR的分离及其功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 MARs的克隆及序列分析 |
| 4.2.2 植物表达载体的构建和烟草转化 |
| 4.2.3 定性分析GUS的表达 |
| 4.2.4 MARs对转基因表达的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 MAR序列介导野苋菜凝集素基因在小白菜中的表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 植物组织培养基 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.1.4 转基因植株的抗蚜性测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 顺向重复连接MAR的植物表达载体的构建 |
| 5.2.2 白菜转化及再生植株的筛选 |
| 5.2.3 白菜转化植株的分子检测 |
| 5.2.5 转基因阳性植株的抗蚜分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 杀虫融合基因的构建 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株与质粒 |
| 6.1.2 计算机软件和网络数据库 |
| 6.1.3 融合基因的构建 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 构建融合蛋白的可行性分析 |
| 6.2.2 融合杀虫基因植物表达载体的构建 |
| 6.2.3 融合基因植物表达载体的构建 |
| 第七章 融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 甘蔗对Hyg的敏感性 |
| 7.2.2 转化后的抗性筛选及抗性愈伤组织分化成苗 |
| 7.2.3 转化植株PCR及Southern杂交检测 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 研究总结 |
| 8.2 后续研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（10）苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的毒素 |
| 1.3 杀虫晶体蛋白的类型 |
| 1.4 杀虫晶体蛋白的作用机制 |
| 1.4.1 晶体在昆虫中肠中的溶解 |
| 1.4.2 中肠膜受体与毒蛋白的结合 |
| 1.4.3 杀虫晶体蛋白引起细胞裂解的机制 |
| 1.4.4 杀虫晶体蛋白引起膜穿孔的分子机制 |
| 1.5 苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的应用 |
| 1.5.1 植物抗虫基因工程 |
| 1.5.2 重组苏云金芽胞杆菌 |
| 1.6 苏云金芽胞杆菌应用的局限性 |
| 1.7 克服苏云金芽胞杆菌的应用局限性 |
| 1.7.1 苏云金杆菌的增效途径 |
| 1.7.2 Bt蛋白的协同增效 |
| 1.8 营养期杀虫蛋白 |
| 1.9 重要的林业和农业害虫 |
| 1.9.1 黄斑星天牛 |
| 1.9.2 小菜蛾 |
| 1.9.3 水稻大螟 |
| 1.9.4 水稻二化螟 |
| 1.10 本论文研究的目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 供试昆虫 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 cry基因PCR-RFLP鉴定 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 模板制备 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 酶切分析 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞制各 |
| 2.2.8 Bt电击感受态的制备 |
| 2.2.9 热击转化 |
| 2.2.10 电击转化 |
| 2.2.11 E.coli质粒DNA提取 |
| 2.2.12 Bt质粒DNA提取 |
| 2.2.13 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.14 DNA回收 |
| 2.2.15 基因在大肠杆菌中诱导表达 |
| 2.2.16 基因在苏云金芽胞杆菌中的表达 |
| 2.2.17 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.18 序列测定及分析 |
| 2.2.19 杀虫测定 |
| 2.2.20数据分析处理 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 新基因的筛选克隆 |
| 3.2 cry1Gb2全长基因的表达 |
| 3.2.1 cry1Gb2全长基因的表达 |
| 3.2.2 杀虫生物活性测定 |
| 3.3 Bt菌株在几种培养基中生长状况的比较 |
| 3.4 对已克隆基因进行表达 |
| 3.5 Bt杀虫蛋白对水稻螟虫的生物活性测定 |
| 3.5.1 Bt蛋白对水稻二化螟生物活性测定 |
| 3.5.2 Bt蛋白对水稻大螟生物活性测定 |
| 3.6 黄斑星天牛饲养及利用Bt蛋白进行活性筛选方法初试 |
| 4.讨论 |
| 5.结果 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术.论文 |
四、转苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因抗虫水稻的GUS和PCR辅助选择（论文参考文献）
- [1]转Bt-pta基因水稻后代分子检测与抗虫性鉴定[D]. 崔彦芹. 贵州大学, 2016(03)
- [2]大豆子叶节遗传转化体系优化及转Cry1Iem基因抗虫新材料的获得[D]. 何禹璇. 吉林农业大学, 2013(S2)
- [3]苏云金杆菌嵌合杀虫蛋白的构建与毒性分析[D]. 董方. 华中农业大学, 2012(01)
- [4]塔形毛白杨CV-BJHR01再生体系的建立及Bt抗虫基因工程的研究[D]. 冯妍. 东北林业大学, 2010(04)
- [5]抗虫基因植物表达载体构建、遗传转化及表达研究[D]. 霍雪梅. 河北农业大学, 2009(10)
- [6]粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌增效作用及应用[D]. 徐健. 扬州大学, 2008(01)
- [7]雪花莲凝集素基因遗传转化甘蔗的研究[D]. 姜立珍. 华南热带农业大学, 2007(03)
- [8]稻纵卷叶螟对Bt水稻抗性风险及其对策初步研究[D]. 张广林. 浙江大学, 2007(03)
- [9]野苋菜凝集素基因的克隆及转基因研究[D]. 邓智年. 广西大学, 2007(05)
- [10]苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究[D]. 冯学. 东北农业大学, 2007(02)