一、大肠杆菌内毒素对Vero细胞培养的作用研究（论文文献综述）
张晓茜[1]（2021）在《PEDV感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱及miRNA影响PEDV复制的机制研究》文中提出自2010年,猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异毒株的出现给世界养猪业带来了巨大损失。猪流行性腹泻（PED）疫苗的问世,发挥了一定的预防作用。但临床上该变异毒株导致的仔猪死亡率仍居高不下,因此,通过不同思路研究PEDV变异毒株的致病机理、免疫机理及调控PEDV复制机理,对防控该病具有重要意义。本研究首先筛选出适用于PEDV变异毒株体外研究的细胞模型-猪睾丸细胞系（ST cells）。在此基础上,通过高通量测序技术,对PEDV变异毒株和其传代致弱毒株分别进行了small RNA和转录组测序及靶向关系分析,研究了PEDV强弱毒株在致病性和影响宿主免疫应答上的差异。研究发现,PEDV能影响miR-155-5P和miR-128在ST细胞中的表达,并且能分别通过靶向PEDV NSP2和宿主真核起始因子2α（e IF2α）,以及NSP13和宿主CBLB基因,抑制PEDV变异毒株YN15的复制。本研究还探索了宿主e IF2α、ATG5、ATG12和CBLB基因在YN15毒株感染ST细胞过程中的作用。主要研究内容如下:1.PEDV变异毒株体外感染细胞模型的筛选为了筛选PEDV变异毒株YN的体外感染细胞模型,本研究运用RT-q PCR、间接免疫荧光和Western Blot方法,比较分析了PEDV变异毒株YN15分别感染ST细胞、Vero细胞和IPEC-J2细胞后的病毒增殖情况。研究结果发现,YN15毒株能在ST细胞中稳定增殖,病毒滴度和病毒蛋白表达量均能达到较高水平。并且PEDV变异毒株的传代致弱株YN144在ST细胞中也能有效复制。倒置显微镜下观察,ST细胞感染PEDV变异毒株后病变明显,易于实验过程中随时观察病毒感染进度,而且其为猪源细胞系,具有完整的信号通路,因此选用ST细胞作为PEDV变异毒株体外复制机制研究的细胞模型。2.PEDV变异强弱毒株感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱分析自PEDV变异毒株出现后,基于经典毒株CV777的疫苗对其控制能力有限。本实验室分离出变异的PEDV YN1毒株,对其体外传代得到YN15强毒株和YN144致弱毒株。本实验室前期通过动物感染试验发现,YN15毒株可以造成仔猪严重的腹泻,而致弱株YN144却不致病,并可以诱导仔猪的先天免疫反应和中和抗体反应。为探究以上现象发生的原因,本研究采用高通量测序技术开展了对YN15毒株和YN144毒株分别感染ST细胞后small RNA和转录组的测序工作,分别获得了差异表达的miRNA和m RNA的表达谱。结果显示,在YN15与未感染细胞、YN144与未感染细胞、YN15与YN144感染细胞3个比较组中,分别有8039、8631和3310个显着性差异表达（DE）的m RNA（p-value<0.05）,以及36、36和22个DE miRNA,并分别用RT-q PCR和茎环RT-q PCR方法验证了测序结果的可靠性。运用miRanda预测了DE miRNA和DE m RNA的靶向关系,共发现了14140、15367和3771个显着性差异表达且呈负相关的miRNA-mRNA相互作用对。最后,使用Cytoscape软件构建了YN15毒株相对于YN144毒株感染ST细胞时,上调的miRNA与下调的m RNA,以及下调的miRNA与上调的m RNA的相互作用网络图。通过生物信息学分析发现,YN15毒株在黏着斑、细胞骨架调节、内吞和细菌入侵上皮细胞等信号通路优于YN144毒株,而YN144毒株在激活NF-κB、JAK-STAT、T细胞受体等免疫相关信号通路中优于YN15毒株。3.miR-155-5p对PEDV YN15毒株复制的影响对YN15毒株感染ST细胞后产生的DE miRNA-mRNA联合分析发现,内质网应激信号通路被激活,此现象提示细胞内质网应激可能与PEDV在ST细胞中的复制相关。研究发现,miR-155-5p可通过其种子序列靶向结合PEDV NSP2基因和宿主e IF2α基因的3’UTR,从而抑制YN15毒株在ST细胞中的复制,并且能够下调ATG5、ATG3等自噬相关基因的转录,下调其靶基因e IF2α的转录,上调MX1和MX2等先天性免疫和IL18、MAPK1等获得性免疫相关基因的转录;用e IF2α磷酸酶抑制剂（Sal003）孵育ST细胞,并接种YN15毒株发现,其能有效降低YN15的复制能力,促进NFKB1、MX2和MAPK1等宿主免疫相关基因的转录。4.miR-128对PEDV YN15毒株复制的影响通过对PEDV变异毒株感染ST细胞后DE miRNA-mRNA的联合分析发现,多个自噬相关基因被显着上调,此现象提示细胞自噬可能与PEDV在ST细胞中的复制相关。通过靶向序列分析发现,过表达miR-128可通过其种子序列靶向结合PEDV NSP13基因,抑制YN15毒株在ST细胞中的复制,并且下调ATG3、ATG5、ATG12等细胞自噬相关基因的转录,上调MX1、MX2等先天性免疫和IL18、MAPK1等获得性免疫相关基因的转录,抑制T细胞受体免疫抑制基因CBLB的转录。为了研究细胞自噬与YN15毒株在ST细胞中复制的关系,将ST细胞同时沉默ATG5和ATG12后,再感染YN15毒株,发现YN15毒株的复制能力显着下降,e IF2AK3等内质网应激相关蛋白、MX1、MX2和MAPK1等与宿主免疫相关基因的转录水平均下降。本研究还发现YN15毒株感染ST细胞后,细胞CBLB基因的转录水平显着上调,而此基因为一种T细胞受体抑制因子,能够抑制宿主的获得性免疫反应。分析发现,ST细胞CBLB基因的3’UTR能被miR-128种子序列靶向结合,抑制其转录。过表达CBLB蛋白能促进YN15毒株的复制,沉默CBLB基因能有效抑制YN15毒株的复制,且能上调NFKB1、IL18等免疫相关因子的表达。综上所述,本研究发现变异PEDV强弱毒株感染ST细胞后,miRNA和m RNA表达谱有显着性差异表达,绘制了miRNA-mRNA互作网络,揭示了miR-155-5p和miR-128抑制PEDV复制的分子机制,为抗PEDV药物分子设计提供了新线索。
陈芸[2]（2021）在《弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究》文中指出刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性胞内寄生的顶复门原虫,可感染几乎所有温血动物的有核细胞,严重危害人和其他动物的健康。当受到弓形虫感染时,宿主启动天然免疫并激活免疫细胞产生大量活性氧（ROS）,通过诱导氧化应激发挥抗弓形虫作用。弓形虫的抗氧化系统在抵御宿主氧化应激过程中发挥重要作用。但目前对抗氧化系统的研究仍不全面,对抵抗活性氧应激反应中起作用的关键基因仍然知之甚少。本试验利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术筛选并鉴定与抗氧化相关的新基因,并初步探索新基因的生物学功能,为进一步研究弓形虫抵抗氧化应激的作用机制提供依据。为确定H2O2对细胞及弓形虫的最佳作用浓度及时间,本研究用含不同浓度H2O2（100、200、300、400、500、600、800μM）的完全培养基培养Vero细胞,利用CCK-8测定H2O2对Vero细胞的毒性,并通过DCFH-DA荧光探针测定安全浓度下Vero细胞内的活性氧水平,确定了H2O2对Vero细胞的最佳作用浓度为200μM。以RH株,ROP5基因缺失株及TR基因缺失株为试验虫株,评估H2O2对弓形虫活力的影响,以确定H2O2对弓形虫的最佳孵育时间,结果显示30 min为H2O2最佳作用时间。在培养基中添加H2O2,评估H2O2对细胞内弓形虫增殖能力的影响,结果表明200μM H2O2可显着抑制细胞内TR-KO株的增殖。因此以200μM H2O2孵育弓形虫30 min,并在培养基中添加H2O2作为筛选抗氧化相关基因的条件。利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术筛选并鉴定抗氧化基因。本研究通过共转染p Cas9-CAT和p Cas9-decoy至弓形虫RH株体内,成功构建持续表达Cas9的RH/Cas9虫株。将sg RNA质粒文库电转至RH/Cas9虫株,经息疟定筛选后,获得弓形虫基因缺失株库;按照上述筛选条件,利用200μM H2O2筛选与抗氧化功能相关的基因。分析sg RNA的富集与丢失情况,选择5个编码假定蛋白（HPs）的基因进行验证。以RH/Cas9虫株为亲本虫株,构建了5个未知基因的基因缺失株（HPs-KO）,验证其对H2O2的敏感性,并测定各虫株的抗氧化能力、入侵及增殖能力,对小鼠的毒力。结果表明,HPs的缺失均不同程度地增加弓形虫对H2O2的敏感性,且与其他缺失株相比,HP1-KO对H2O2最敏感。各缺失株的抗氧化能力、入侵及增殖能力、对小鼠的毒力均降低于RH株。为进一步研究HP1的功能,构建了HP1的原核表达质粒p ET-32a-HP1,并制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光对HP1进行定位分析,并利用鼠多抗体进行Co-IP和质谱分析。以RH株构建HP1基因缺失株（HP1-KO）,并构建HP1互补株（HP1-CO）,利用RNA-seq技术分析HP1缺失对虫体内相关基因表达量的影响。结果表明,HP1定位于弓形虫细胞膜上;质谱结果发现与HP1相关的蛋白主要参与核糖体及多种代谢途径,如糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢等。RNA-seq测序结果表明,与RH株相比,HP1缺失株中有710基因差异表达,其中上调的基因有48个,下调的基因有662个,且差异基因主要富集于细胞过程、代谢过程、催化活性和结合,KEGG分析发现,差异基因主要参与Jak-STAT信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、细胞衰老、脂肪酸生物合成等。由上述结果表明HP1主要影响弓形虫的代谢过程,与CAT分解H2O2的能力不同。因此,在HP1-KO株基础上,构建HP1与CAT的双基因缺失株（HP1/CAT-KO）,测定HP1/CAT-KO对H2O2的敏感性,分析其在小鼠体内的增殖情况及对小鼠的毒力。结果表明HP1/CAT-KO对H2O2的敏感性显着高于单缺失株,在小鼠体内的增殖速度显着低于RH株和单缺失株,延长感染小鼠的存活时间。最后,本研究还对CRISPR/Cas9全基因组筛选中发现的AKHP基因进行初步功能研究。生物信息学分析发现AKHP具有典型的2-Cys-Prx的结构域;经定位分析发现该蛋白定位于弓形虫胞质中;利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建了AKHP基因缺失株（AKHP-KO）及互补株（AKHP-CO）,测定不同的虫株的入侵及增殖能力,对H2O2敏感性、抗氧化能力,并通过荧光定量PCR测定AKHP-KO中其他抗氧化基因的m RNA表达情况。结果表明,AKHP-KO的增殖能力显着降低,对H2O2的敏感性显着增加,抗氧化能力降低;与RH株相比,AKHP基因缺失株中Prx2的表达量显着升高。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术成功筛选并鉴定5个未知的抗氧化基因和一个具有典型2-Cys-Prx结构域的AKHP基因,并对两个基因进行初步功能研究,为进一步研究弓形虫抵抗氧化应激的作用机制提供依据
王汉石[3]（2020）在《硫化氢对内毒素导致成骨细胞凋亡影响的研究》文中提出目的:慢性骨髓炎难治愈,给患者带来了巨大的痛苦和昂贵的经济负担。慢性骨髓炎的治疗周期需要多次手术而且较长的住院时间,很多病例难以完全根治,会影响患者的生活质量以及社会的经济发展。以往认为,金黄色葡萄球菌是骨髓炎中的主要致病菌。对慢性骨髓炎致病菌谱的研究总结可以发现,目前革兰阴性杆菌比例不断升高,所以对革兰阴性杆菌在慢性骨髓炎疾病发展过程中的具体机制应该进一步研究,为针对性的疗法提供新的思路。能够代谢有机硫化物的酶普遍存在于微生物中。微生物通过释放硫化氢使硫化氢参与到微生物的许多生理过程中,例如防御抗生素,信号传递和能量代谢。与微生物相似,人体内也有多种代谢产生硫化氢的酶。硫化氢被认为是继一氧化氮和一氧化碳以后的第三种内源性信号气体分子。然而,关于硫化氢在骨髓炎感染过程中的具体作用尚不清楚。第一部分研究拟探索几种慢性骨髓炎中常见的革兰阴性杆菌在体外及体内的硫化氢释放情况,确认其释放硫化氢的浓度,并为后续的研究提供理论及实验基础。在骨髓炎期间,由于骨基质合成减少和成骨细胞凋亡率增加,新骨沉积减少,导致骨质丢失。细胞外细菌成分可能会减少成骨细胞。细胞质炎性体激活可能与自分泌/旁分泌死亡受体配体信号协同作用以诱导细胞死亡。所以,控制感染骨细胞的凋亡途径可能是限制骨髓炎炎症损伤的一种有吸引力的新方法。革兰阴性菌的主要致病物为内毒素。内毒素可以通过直接或者间接作用促进成骨细胞凋亡。Caspase家族蛋白的高度表达是凋亡发生的重要标志。凋亡启动后,细胞内底物分裂、染色质浓缩、DNA断裂、以及最终细胞死亡。除了促凋亡作用的Caspase家族,细胞的凋亡过程还受到Bcl-2家族蛋白的抗凋亡作用。目前,针对细菌性骨破坏的有效治疗仅限于抗生素方案和外科手术策略来治疗感染性骨疾病。因此研究可能恢复成骨细胞功能下降的药物仍是预防感染性骨疾病骨质破坏的主要目标。第二部分研究通过探讨革兰阴性菌产生硫化氢对其引起成骨细胞凋亡的作用,试图为新的治疗方案提供新的思路。细胞的凋亡受其内在多种信号通路的调节。近年来,PI3K/AKT信号通路已被发现在细胞多项生理活动的调节过程中起到重要作用,研究发现AKT在多种细胞中起到抗凋亡作用。另外AKT通路还可以与其他信号通路互相作用,起到抑制凋亡的作用。AKT通路下游涉及到多个信号通路。NF-κB相关通路就是其中重要的一个信号通路。激活的AKT可以磷酸化的IKK,进而磷酸化与NF-κB相连的IκB。IκB作为转录因子可以调控一系列基因表达。对AKT通路的抑制会引起对NF-κB通路的抑制,进而使细胞中生存因子的表达降低,促进细胞凋亡。多个实验发现硫化氢可以抑制AKT的磷酸化,因此,第三部分实验要验证是否硫化氢通过抑制AKT磷酸化及下游NF-κB通路激活,促进了凋亡蛋白的表达,加剧了成骨细胞的凋亡。研究方法:在体外NB培养基中培养三种细菌大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌,分别用平板计数法制备106CFU/mL浓度的三种细菌悬液备用。将NaHS梯度稀释浓度,作为标准比较硫化氢在醋酸铅试纸上产生黑色沉淀的量。比较不同菌液和NaHS组37℃过夜后试纸上产生的黑色沉淀,估计三种细菌在培养基中产生硫化氢的量。取40只SD大鼠根据随机数法分出对照组和大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌三种细菌实验组,每组10只。腹腔麻醉后胫骨钻孔后根据分组注射入细菌悬液或无菌NB培养基。术后三周经腹腔过量麻醉处死。处死后取大鼠胫骨标本固定后进行HE染色。并取病灶周围组织进行组织硫化氢含量测定。培养MC3T3-E1和hFOB两种成骨细胞细胞系。将MC3T3-E1和hFOB分别用梯度浓度硫化氢供体单独处理或者与LPS共同处理,培养2天后进行MTT检测,比较硫化氢单独处理或者与LPS共同处理时对细胞增殖能力的影响。将成骨细胞分为三组:（1）对照组;（2）LPS单独处理组以及（3）LPS合并硫化氢共同处理组。对三组进行流式细胞学检测、Hoechst染色以及Western blot,观察不同情况成骨细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白表达情况。三组细胞处理后,更换成骨诱导培养基培养,进行ALP及qPCR检测,观察不同情况对成骨细胞成骨能力的影响。对三组进行免疫荧光及Western blot检测,观察不同情况下细胞中AKT/NF-κB通路相关蛋白的表达情况。应用AKT激活剂后,进行流式细胞学,qPCR,ALP及茜素红检测,进一步检验AKT通路在凋亡及成骨过程中的作用。结果:1、革兰阴性菌可以在体外释放硫化氢,本研究的三种革兰阴性菌:大肠杆菌、阴沟肠杆菌和克雷氏肺炎杆菌,在NB培养基中均可以产生硫化氢,而且产生硫化氢的浓度在50-100μM之间。大鼠骨髓炎模型HE染色后,在镜下可见三种细菌感染后的骨组织中可见炎症细胞浸润及骨小梁结构破坏,说明细菌感染造模成功。用硫化氢检测试剂盒检测。结果显示三种细菌感染后骨髓炎局部组织中的硫化氢浓度明显升高。上述实验结果表明,大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌三种慢性骨髓炎常见的革兰阴性菌在体内及体外均可以产生硫化氢。2、硫化氢促进LPS对成骨细胞的凋亡作用,而且加重LPS对成骨细胞增殖和成骨功能的抑制。用两种不同浓度的硫化氢供体分别处理两种成骨细胞,与对照组相比,两种成骨细胞的增值率在硫化氢0-100μM范围内均无明显降低。然而,硫化氢与LPS共同作用时,两组细胞系内的增值率均有所下降,而且呈剂量相关。说明硫化氢可以加重LPS对成骨细胞增殖的抑制效果。与LPS单独处理组相比,硫化氢与LPS共同处理组凋亡率降低而且的Hoechst染色结果显示凋亡细胞数增加,另外凋亡相关的蛋白表达也有所增加。这些结果都说明硫化氢可以促进LPS对成骨细胞凋亡作用。诱导成骨后的qPCR及ALP检验结果显示硫化氢及LPS组合组较LPS组中,成骨细胞成骨相关基因的表达以及产生ALP的量降低。这提示硫化氢能加强LPS对成骨功能的抑制。应用FAS特异性抑制剂后,成骨细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白表达降低,说明硫化氢过FAS凋亡通路影响成骨细胞的凋亡过程。3、硫化氢通过抑制AKT/NF-κB信号通路影响LPS对成骨细胞的作用。Western blot及免疫荧光结果显示,硫化氢抑制pAKT及p65蛋白表达。使用pAKT激活剂以后,pAKT表达明显升高。成骨细胞的凋亡率以及成骨能力都明显上升。另外硫化氢抑制COX-2的表达,这可能与硫化氢对成骨功能的抑制有关。结论:1、慢性骨髓炎中常见的革兰阴性菌在体外及体内都可以释放硫化氢,体外释放浓度在50-100μM之间;2、在硫化氢作用下,内毒素对成骨细胞的增殖与成骨作用起抑制作用;3、在硫化氢作用下,内毒素对成骨细胞的促凋亡水平提高;4、硫化氢与内毒素对成骨细胞的促凋亡机制与FAS凋亡通路有关;5、硫化氢通过抑制AKT/NF-κB通路引起对成骨细胞的促凋亡作用。
余迮艳秋[4]（2019）在《抗PEDV复制ISG分子的筛选及OASL抗病毒机制研究》文中进行了进一步梳理猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的仔猪腹泻疾病,其临床症状常表现为仔猪腹泻、呕吐、脱水直至死亡,给全世界养猪业造成了重大损失。PEDV是有囊膜病毒的单股正链RNA 病毒,基因组结构依次为,5’UTR-ORF1a/b-S-E-ORF3-M-N-3’UTR。PEDV在临床流行和细胞传代过程中,基因组不断变异,其中纤突蛋白（S）具有较好的免疫原性。干扰素刺激基因（Interferon stimulated genes,ISGs）是干扰素发挥抗病毒作用的主要效应物,并且在针对微生物感染的先天免疫防御中起到主要作用,尤其在病毒感染期间,ISGs的抗病毒作用可以有效控制病毒的复制和传播。2’-5’寡腺苷酸合成酶样蛋白（2’-5’oligoadenylate synthetase-like,OASL）可由干扰素诱导产生,在干扰素介导的抗病毒固有免疫中发挥重要作用。1基于转录组分析筛选抗PEDV复制的ISGs分析PEDV 85-7亲本株和C40细胞传代株的生长曲线,发现C40株在干扰素缺陷型Vero细胞上复制滴度显着高于亲本株,而在干扰素正常表达MARC-145细胞上,滴度却显着低于亲本株,并且C40株可以诱导MARC-145细胞产生Ⅰ型干扰素,采用转录组分析比较两株PEDV诱导的ISGs差异,经qPCR验证,OASL、RSAD2、USP18、ISG15、TRIM16、STAT2、ATF1、IFIT2、IFIT3、IFIT5、IFI16和IFI35 等基因的表达存在差异,利用pEGFP-N1质粒构建了上述12个基因的重组质粒,并分别转入MARC-145细胞中,瞬时过表达蛋白后接种PEDV 24h后,用空斑试验检测细胞上清病毒量,qPCR检测细胞内病毒复制水平,结果表明OASL、RSAD2、STAT2能使病毒量下降约60%;ISG15、TRIM16、IFIT2使病毒量下降约50%,证实OASL、RSAD2、STAT2、ISG15、TRIM16和IFIT2是抗PEDV复制的ISG分子,同时暗示这些ISGs的上调表达是造成C40细胞传代株与85-7亲本株生长特性差异的重要原因之一。2 OASL蛋白抑制PEDV复制的机制初步研究进一步研究OASL的抗病毒机制,发现瞬时过表达OASL后能够显着抑制PEDV在MARC-145细胞上的增殖,与之对应的是利用siRNA干扰技术瞬时沉默OASL可以促进PEDV的增殖,证明OASL对PEDV的复制具有抑制作用。通过共转染OASL和si RNase L,发现沉默RNase L并不影响OASL的抗PEDV作用,证明OASL抗病毒作用并不依赖于经典的OAS/RNase L途径。过表达OASL可以显着提高IFN-α转录水平,沉默OASL则下调IFN-α转录水平,并且发现在干扰素缺陷型Vero细胞上过表达OASL并不发挥OASL的抗PEDV作用。随后通过Co-IP试验证明了 OASL与RIG-1有直接互作,而非MDA5,另外共表达OASL和RIG-1同样可以促进IFN-α转录水平。提示OASL可作为抗PEDV的ISG分子,并且是通过RIG-1介导的Ⅰ型干扰素途径发挥抗病毒作用,而非经典的OAS/RNase L途径,有助于进一步阐明宿主先天免疫对抗PEDV感染机制。3猪流行性腹泻病毒中和位点原核表达及抗体制备利用生物学软件,预测了 PEDV S1蛋白中可能包含中和线性表位的区域,命名为S582;参考PEDV经典株CV777中已证实的中和表位,预测了 3个含有相应中和表位的截断片段,命名为COE、894和CSS。分别扩增PEDV 85-7亲本株和311-1病料分离株中这4种目的片段。构建含有该目的基因的pET-32a重组质粒,蛋白纯化得到高浓度的S582蛋白,免疫新西兰大白兔,免疫4次后,Protein A/G纯化得到兔多克隆抗体。结果表明,该免疫血清效价达到1:128,000,但无中和效价,说明此S582序列并不包含PEDV线性中和表位。
张健淞,夏雨婷,沈懿娟,梁中洋,李玉峰[5]（2018）在《巴氏杆菌toxA基因的原核表达及生物学特性研究》文中指出为了探讨多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素（PMT）对真核细胞的致病机制,将编码PMT的tox A基因以及其N端tox N（11461 bp）和C端tox C（2 9583 858 bp）分别克隆到原核表达载体p ET-32a中进行蛋白表达。3个重组蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式表达,其分子质量大小分别为176 ku、88 ku和67 ku,均能与His单克隆抗体发生特异性免疫反应。体外细胞毒性试验和豚鼠皮肤坏死试验均表明,r PMT与天然PMT具有相同的生物学功能。此外,以原核表达蛋白r PMT-N和r PMT-C分别制备的鼠多抗为一抗,对转染表达N端和C端真核质粒的Vero细胞进行IFA和Western-blot检测。结果表明,2种蛋白特异性良好,制备的多克隆抗体免疫反应条带单一。该研究的成功开展将为后续探究PMT细胞内作用机制提供可靠的生物材料。
黄立[6]（2017）在《豫南地区鸡大肠杆菌病病原学调查与防控研究》文中指出目前,鸡大肠杆菌病作为一种重要的细菌性传染病,对我国养鸡业造成了严重危害。根据信阳市疫病检测工程中心（信阳农林学院市级工程中心）对豫南地区主要养鸡集中区的调查,在规模化养鸡场细菌性疾病当中,大肠杆菌发病率一直居于首位。鸡大肠杆菌血清型众多,耐药菌株也在不断增多,给防治本病增加了难度。因此,开展豫南地区鸡大肠杆菌病病原学调查与分析,对于有效防治鸡大肠杆菌病,具有重要的理论和实践意义。本研究涉及到豫南地区鸡致病性大肠杆菌分离与鉴定、对常用抗菌药物耐药性分析、中药活性成分与氨基糖苷类药物体外联合抗菌作用、利用优势致病菌株研制多价灭活苗等方面。通过系列研究,进一步弄清楚豫南地区鸡大肠杆菌病的流行状况,必将为豫南地区乃至河南的鸡大肠杆菌病科学防治工作,提供重要的理论依据和临床价值。1豫南地区鸡致病性大肠杆菌分离与鉴定对于豫南地区送检的164份病鸡样品,经过常规方法培养、纯化及镜检,并进行生理生化鉴定和PCR鉴定,共分离到鸡大肠杆菌121株,鉴定出88株分离菌株血清型,包括17种血清型;主要血清型是02、078、01、018、026、022,共72株,占总分离株的59.50%。给供试雏鸡接种121株分离菌株后,可见发病症状及剖检病变都与本病特征相符;在121株分离菌株中,有64株高致病性菌株、31株中度致病性菌株、26株低致病性菌株,分别占总试验菌株的52.9%、25.6%、21.5%。2对常用抗菌药物耐药性分析采用标准微量稀释法,测定62株鸡大肠杆菌对18种药物的体外最小抑菌浓度（MIC）,并通过PCR方法扩增I型整合酶基因。结果显示,全部菌株呈现多重耐药,耐药谱型达12种之多;对β-内酰胺类、酚胺醇类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类等抗菌药物,均表现出不同程度的耐药性;对土霉素、复方新诺明、磺胺嘧啶、强力霉素四种药物,耐药率分别为95.2%、87.1%、80.6%、72.6%;I型整合酶基因检出率为87.1%。由此表明,鸡大肠杆菌临床分离株,对常用抗菌药物都产生了不同程度的耐药性。3中药活性成分与氨基糖苷类药物体外联合抗菌作用采用棋盘稀释法,了解中药活性成分与氨基糖苷类药物体外联合抗菌作用,进而筛选出具有协同抗菌效果的药物组合,为体内试验提供理论基础。结果表明,穿心莲内酯与氨基糖苷类药物联用,主要表现为协同作用;黄芩苷和小檗碱分别与氨基糖苷类药物联用,主要表现为相加作用;蒲公英提取物与氨基糖苷类药物联用,主要表现为无关作用。由此表明,穿心莲内酯与氨基糖苷类药物联合使用,可提高抗菌药物对耐药大肠杆菌的抗菌效果。4鸡大肠杆菌多价灭活苗制备与评价利用毒力强、免疫原性好、具有地方代表性的O1、O2、O78、O22、O26、O18六种优势血清型菌株,研制鸡大肠杆菌氢氧化铝胶多价灭活苗。免疫攻毒试验结果显示,疫苗对各日龄鸡的安全性较好,采用大肠杆菌菌株攻毒,免疫组可获得完全保护,说明该疫苗对大肠杆菌病免疫效果显着。这些研究成果,对于有效防治豫南地区鸡大肠杆菌病,提高豫南地区整体养鸡水平,具有重要指导意义。
郇长超[7]（2016）在《HMGB1在猪流行性腹泻病毒感染中作用机制的研究》文中提出猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种以水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征的猪肠道传染性疾病,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。尽管对PEDV致病机制进行了一定的研究,取得了一系列有重要意义的成果,但在病毒的侵染机制及与宿主细胞之间的相互作用机制等方面,研究的较少,是近年来被广泛研究的热点。本研究主要针对HMGB1在PEDV感染中作用机制进行了深入探讨,系统分析了 PEDV感染与宿主蛋白HMGB1相互关系的机制。主要研究内容包括:1.甘草素对PEDV的抗病毒效果甘草素是一个来源于传统中药甘草的天然产物。通过western blot、荧光定量PCR和噬斑形成试验证明了甘草素具有抑制PEDV感染Vero细胞的效果。此外,探索了甘草素抑制PEDV感染的作用过程,发现甘草素对PEDV的入胞和复制有影响,而对细胞、病毒粒子本身、病毒的组装和释放没有影响。2. HMGB1在甘草素的抗病毒过程中起着重要的作用HMGB1是一个细胞中含量非常丰富的核蛋白,能作为一个重要的炎性介质释放到胞外空间调节宿主的炎症反应。我们发现甘草素能降低由PEDV感染引起的促炎性因子（IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α）的升高,且Poly（I:C）引起促炎性因子的升高且促进了PEDV的感染。甘草素是HMGB1的竞争性抑制剂。通过HMGB1抗体中和试验和siRNA干扰HMGB1表达,发现HMGB1在感染条件下对促炎性因子的升高起着重要的作用。HMGB1可与TLR4和RAGE等受体相结合,因此利用TLR4的抑制剂和RAGE的siRNA处理细胞,发现TLR4抑制剂和siRAGE能降低促炎性因子的升高和病毒的感染,且过表达HMGB1的突变体（PCA-C45S、PCA-C106S、PCA-C45106S）可降低促炎性因子的升高和PEDV的感染。此外,我们还证明了 HMGB1与TLR4和RAGE结合后可激活P38MAPK来诱导促炎性因子的升高进而有利于PEDV的感染。总之,甘草素与胞外HMGB1结合后,降低了其与TLR4和RAGE受体的结合,从而降低了P38MAPK的激活,使促炎性因子降低来抑制PEDV的增殖。3.硫酸类肝素是猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞的吸附因子许多病毒利用硫酸类肝素作为它们的吸附因子。在该研究中,证明了 PEDV利用硫酸类肝素吸附Vero细胞。Western blot分析、荧光定量PCR和噬斑形成试验揭示被肝素预处理的病毒,共感染细胞的能力受到抑制;而用肝素预处理细胞,对PEDV的感染没有抑制效应。其次,我们发现肝素酶Ⅰ处理细胞去除硫酸类肝素后,细胞对PEDV的易感性下降。另外,我们证明抑制硫酸类肝素生物合成的氯酸钠处理细胞,能够有效抑制PEDV的感染。我们还检测了不同程度硫酸化的两个肝素类似物对PEDV感染的影响,数据表明N-去硫酸化肝素（不是N-乙酰化O-去硫酸化肝素）预处理病毒能够降低病毒感染细胞的能力。此外,肝素可抑制PEDV的复制和HMGB1 mRNA水平。总之,研究表明硫酸类肝素是PEDV感染Vero细胞的吸附因子。4. PEDV N蛋白通过与C/EBP-β相互作用来正调HMGB1的转录及乙酰化和释放HMGB1是一个重要的促炎性介质并且促进多种炎性疾病的发生。发现了 PEDV感染导致HMGB1的乙酰化和释放,PEDV的感染和PEDV衣壳蛋白通过SIRT1、组蛋白乙酰转移酶和NF-κB调节HMGB1的乙酰化。过表达PEDVN蛋白能促进HMGB1的乙酰化和释放。CHIP试验表明PEDVN能与HMGB1启动子区DNA相互作用。双荧光素酶报告基因试验证明了 PEDVN蛋白介导的HMGB1的转录与转录因子C/EBP结合基序有关。用Co-IP试验进一步表明病毒的衣壳蛋白与C/EBP-β相互作用来正调HMGB1基因的转录。总之,PEDV感染能引起HMGB1的乙酰化和释放,且主要是PEDV N蛋白起作用。我们的结果对PEDV的发病提供了新的视角并且为发展以HMGB1为靶点的治疗方法和药物提供了理论基础。5.猪流行性腹泻病毒通过DNA损伤引起HMGB1的释放由DNA病毒激活的DNA损伤反应被广泛的研究。然而,RNA病毒引起DNA损伤反应的研究很少。因此通过western blot和间接免疫荧光揭示了 PEDV快速激活H2AX的磷酸化,且HY增加了 PEDVN蛋白的表达。此外,通过western blot、qRT-PCR和噬斑形成试验证明DNA-PK抑制剂（NU7441）和ATM抑制剂（KU-55933 ）抑制了 HMGB1的释放和PEDV的感染,且DNA-PK的抑制剂效果更好。但是ATR的抑制剂（VE-821）对PEDV感染没有影响。此外,PEDV引起PARP1的激活,PARP1的抑制剂3-AB抑制了 HMGB1的释放及PEDV的感染。DNA-PK抑制剂（NU7441 ）和ATM抑制剂（KU-55933）抑制了 PARP1的活性,表明PEDV主要通过诱导DNA-PK依赖的DNA损伤和部分ATM依赖的DNA损伤激活PARP1和PEDV的增殖。通过流式细胞术证明了 PEDV引起ROS的升高,且抑制DNA损伤和PARP1的激活能降低ROS。总之,PEDV通过DNA损伤/PARP1/ROS引起HMGB1的释放从而有利于自身的复制。
钟菲菲[8]（2014）在《单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体RL1序列抗凋亡作用的研究及其编码的microRNA的筛选》文中提出单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）是人类疾病常见的病原体，在体内易引起持续潜伏感染,当免疫力低下时,可反复被激活，难以治愈。HSV-2的潜伏感染是生殖器疱疹易复发、难根治的主要原因。潜伏相关转录体（LAT）是HSV在潜伏感染时唯一大量存在且高表达的病毒RNA，LAT在HSV潜伏状态建立、维持和复活中发挥作用。目前有关LAT的作用假说很多，但具体是哪一种作用机制尚不明确。LAT不能编码蛋白质，但是LATs能够编码多个有功能的miRNA，microRNA能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对,引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控，miRNA可能在潜伏感染中发挥重要作用。在病毒潜伏期间LAT编码的miRNA对其靶基因进行干扰作用，抑制细胞凋亡，使病毒长期潜伏。为此，本研究以HSV-2333基因组为模板PCR扩增HSV-2LAT RL1序列，构建重组真核表达载体pEGFP-RL1。通过脂质体和电转染两种方法转染将重组子转染进Vero细胞和PC12细胞，G418对重组子进行稳定筛选，确定稳定表达的细胞，研究重组子在Vero细胞GenBank及PC12细胞中的表达及其抗凋亡作用，并利用Real-time PCR的方法确定RL1所编码的microRNA，明确RL1是通过编码microRNA来执行抗凋亡功能的。首先根据中的LAT RL1序列设计引物，以HSV-2333基因组为模板PCR扩增HSV-2LAT RL1片段，构建重组质粒pEGFP-RL1。重组质粒转染入Vero细胞和PC12细胞，并通过RT-PCR和荧光显微镜确认LAT RL1序列在Vero细胞和PC12细胞中成功转录和表达。凋亡诱导剂放线菌素D（ActD）诱导建立细胞模型，重组质粒在转染试剂的作用下转染进Vero细胞和PC12细胞，G418对重组子进行抗性筛选，然后通过Hochest33342染色，荧光观察，JC-1荧光染色从定性的角度确定RL1序列具有抗放线菌素D诱导的Vero细胞和PC12细胞的凋亡作用。MTT结果表明转染了重组质粒pEGFP-RL1的Vero细胞和PC12细胞经放线菌素D凋亡诱导后细胞活性与未经任何处理的正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），但高于放线菌素D诱导凋亡的细胞组及与转染空质粒。pEGFP-C2且放线菌素D诱导凋亡的细胞组，差异具有统计学意义（P<0.05）。流式结果表明，转染重组质粒pEGFP-RL1且经放线菌素D诱导凋亡组与正常对照组凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）,而显着低于放线菌素D诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2且经放线菌素D诱导凋亡组，差异显着（P<0.05）。Caspase-3活性检测表明转染重组质粒的细胞组caspase-3活性与正常对照组无显着差异，而明显低于空质粒组差异有统计学意义（P <0.05）。DNA Ladder重组质粒pEGFP-RL1且经放线菌素D诱导凋亡组与正常对照组未见凋亡条带，放线菌素D诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2且经放线菌素D诱导凋亡组出现大小不等的小片段。ReaL-time PCR显示RL1序列能编码5种microRNA，（miR-H3, miR-H4-3p,miR-H4-5p,miR-H24和miR-H19），且在Vero细胞和在PC12细胞里面，这5中microRNA的表达量是有差异的，这说明microRNA的表达具有组织特异性。且LAT RL1主要是通过这5种microRNA来执行抗凋亡功能的。综述以上研究结果表明，HSV-2LAT基因RL1片段具有抗放线菌素D在Vero和PC12细胞中诱导的细胞凋亡的功能。且此功能的发挥主要是通过RL1序列编码的microRNA来发挥的。本实验研究为探究有关HSV-2LAT介导的病毒的潜伏和复发的机制打下一定基础。
魏麟[9]（2011）在《猪LBP和BPI基因多态性及其蛋白质N端功能研究》文中研究表明决定G-病原菌致病的主要因子是其细胞壁外膜成分——脂多糖（LPS）或称内毒素,内毒素血症及与其有关的疾病是人和动物感染死亡的重要原因。内毒素结合蛋白及其受体在机体识别与调控内毒素作用中发挥重要作用,尤其脂多糖结合蛋白（LBP）与杀菌/通透性增加蛋白（BPI）起了关键作用。BPI对G-具有广泛的杀菌作用,在机体内被喻为“超级抗生素”。LBP能与LPS结合,并经过胞内信号传递诱发炎症反应,LBP与炎症反应有着重要的关系。本研究选取具有能杀灭多种G-及中和细菌内毒素的BPI和内毒素结合蛋白/特异受体LBP为研究对象,通过对猪LBP和BPI基因遗传变异研究,克隆猪LBP和BPI基因的功能片段,并初步探讨其功能,取得如下结果：1、通过对猪BPI基因内含子10和LBP基因内含子9 DNA研究,发现猪BPI内含子10存在12个SNP位点和1个263bp插入/缺失片段；猪LBP内含子9存在9个SNP位点。分别应用特异PCR和PCR-RFLPs技术检测了猪BPI基因内含子10长度多态性和猪LBP基因内含子9的1个SNP位点（T334C）的多态性,结果表明：凉伞猪、龙潭猪群体中BPI基因内含子10长度多态性发现有A和a两个等位基因存在,该两种等位基因A/a频率在两个群体中分别为0.582/0.418和0.799/0.201。LBP基因内含子9的1个SNP位点（C344T）也具有两种等位基因T/C,在凉伞猪、龙潭猪群体中均被检测到,等位基因T/C频率在两个群体中分别为0.782/0.218和0.688/0.312。基因座在两群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。应用最小二乘法模型分析,发现猪BPI基因长度多态的AA与aa基因型个体在45日龄重、6月龄重和6月龄胸围上存在显着差异（P<0.05）,AA基因型的初生重、45日龄重、60日龄重、4月龄重、6月龄重、6月龄体高、6月龄体长、6月龄胸围均优于aa基因型个体。不同基因型个体间初生重、60日龄重、4月龄重、6月龄体高和体长差异不显着（P>0.05）。对于LBP基因第9内含子的SNP多态,暂未发现其对生长性状造成显着影响。本研究结果还有待于在更多的群体中进一步验证和确认,以明确能否应用于猪标记辅助选择育种。2、本研究从血液总RNA中克隆出猪BPI和LBP的全长cDNA序列。猪BPI基因1874 bp（基因登录号：FJ810853）,其1452 bp的开放阅读框编码483个氨基酸残基,含13.25%的亮氨酸,有一段27个氨基酸的信号肽序列；猪LBP基因1648 bp,其1446bp的开放阅读框编码481个氨基酸残基,含14.94%的亮氨酸,有一段25个氨基酸的信号肽序列；序列相似性分析结果显示,哺乳动物BPI在进化过程中具有较高的保守性,与人、牛、兔、狗、大鼠、小鼠、鲤鱼、非洲爪蟾、大西洋鲑和大黄鱼的BPI分子氨基酸序列的相似性分别为64%,,74%,59%,67%,53%,51%,35%,44%,28%和27%。该蛋白氨基端部分和羧基端部分为两个明显不同的功能区,各存在一个超活性结构域。LBP在进化过程中具有较高的保守性,与人、牛、兔、鹿、大鼠、小鼠、猴的LBP分子氨基酸序列的相似性分别为74%,77%,66%,76%,63%,64%和73%。通过对猪BPI和LBP的生物信息学分析,推测猪BPIN端肽具有杀菌活性,猪LBPN端肽具有与LPS的类脂A结合的功能,但不介导信号传导。研究结果对阐明猪BPI和LBP在介导机体免疫反应机制中的作用具有重要意义,为寻找诊断、预防和治疗免疫相关疾病的新策略提供重要的理论基础。3、通过设计猪BPI氨基部分特异性引物（引物的末端包含特定的酶切位点）,成功克隆了猪BPIN端DNA序列,并正确插入原核表达载体pET32a（+）中,进行原核表达,对该重组蛋白进行分离纯化,测定重组蛋白的体外杀菌活性。结果显示,重组猪BPI肽对G+无杀菌能力,与G-作用在20min-2 h内杀菌力最强；重组猪BPI肽在—20、4、20、40和60℃作用30 min仍具有明显的杀菌活性；在不同pH值条件下的杀菌活性表现为酸性条件下增强,碱性条件下弱；对于同一细菌表现为浓度越高杀菌力越强。本研究构建了一株生产重组猪杀菌蛋白的基因工程菌,该菌株被命名为E.coli BL21（DE3）-pET32a（+）-pBPIN,已被中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC M 2011252,并已申报国家专利。4、同样地,通过设计猪LBP氨基部分特异性引物（引物的末端包含特定的酶切位点）,成功克隆了猪LBP N端DNA序列,并正确插入真核表达载体pcDNA3.1 （+）中,重组质粒转染Vero细胞,转染后成功用RT-PCR和Western blot检测到重组质粒的转录产物和重组蛋白。利用电脉冲介导,将重组质粒免疫小鼠双侧胫骨前肌,然后用鼠伤寒沙门氏菌进行攻毒,测定小鼠体温及血液中的部分免疫指标：白细胞数、中性粒细胞数和淋巴细胞数等。结果显示,第1周测定项目白细胞数对照组和重组质粒组之间有显着差异（P<0.01）,淋巴细胞数、中性粒细胞数对照组和重组质粒组之间均无显着差异（P>0.05）；第2周、第3周、第4周所测指标在对照组和重组质粒组之间均有极显着差异（P<0.01）。说明注射重组质粒小鼠的抗炎能力明显优于注射空质粒小鼠。
潘文武[10]（2009）在《大肠杆菌内毒素对小鼠繁殖机能及肝脏部分生化指标影响》文中研究表明【目的】:研究资料表明,LPS对动物对动物的生殖发育过程有不利影响,它能造成动物以及人的卵泡发育受阻、排卵数减少、胚胎发育停滞、早期胚胎流失、流产、早产等问题。目前国内外关于LPS对胚胎附植的影响的研究还较少,本实验主要目的是研究LPS对小鼠胚胎附植以及体外受精-胚胎发育的影响;同时也观察了LPS对小鼠的卵泡发育、排卵数的影响;并对小鼠血液中的内毒的浓度进行了检测,结合部分肝脏生化指标的变化进一步了解LPS对小鼠繁殖机能影响的可能性以及严重程度。【方法及结果】:1)卵泡发育及排卵试验:3-4周龄昆明系小鼠,体重16-19g,分成4个组,其中一个对照组,3个试验组,每组7只。分别给试验小鼠腹腔注射12mg/kg、8mg/kg、4mg/kg LPS并利用PMSG-HCG做同期发情、超数排卵处理;对照组则用无菌生理盐水代替LPS,其他处理相同。卵泡发育试验在腹腔注射PMSG48h后处死采取卵巢制作组织切片并观察;排卵试验则在腹腔注射HCG后14-16h处死,从输卵管壶腹部分离出卵丘卵母细胞复合物,对排卵进行计数。试验发现,与正常对照组相比,试验组小鼠卵泡发育情况以及排卵数并没显着差异。2)LPS对小鼠IVF以胚胎附植的影响:1ng/ml的LPS浓度分别加入到精子获能液、体外受精液、胚胎培养液中并没对受精率、胚胎发育率、胚胎速度以及发育形态产生显着影响;在妊娠0.5D或者4.5D,或者0.5-2.5D连续给药,给药量在1.5mg/kg以内时成年雌性小鼠子宫角内的胚胎数没有受到显着抑制,但存在较大的个体差异。3)小鼠血液中毒素的检测及部分肝脏生化指标的测定:试验分7个组,其中两个对照组（6h和72h对照）和5个试验组（6h,12h,24h,48h,72h组）,对照组腹腔注射无热源生理盐水、试验组给予4mg/kgLPS。各组分别在各自的时间段采血处死,并取肝脏做组织匀浆测生化指标。试验发现在腹腔注射4mg/kgLPS后12h小鼠血液中的LPS浓度达到高峰,此后迅速下降,48h后达到最低值。并且显着低于生理盐水对照组（P＜0.05）。随着血液中LPS浓度的变化,试验中还观察到肝脏中GOT、GPT在6-12h内降低到最低值（P＜0.05,P＜0.01）;自由基NO在12h时的含量与对照组相比显着升高（P＜0.01）,SOD、MDA的变化也体现了肝脏受损的迹象,在自由基升高的同时,超氧化物歧化酶活力降低（P＜0.01）,而MDA含量则显着升高。【结论】:本研究可得出以下结论:055:B5LPS能造成机体毒效反应和肝脏的损伤,但未能证实对小鼠卵泡发育、排卵以及胚胎附植产生明显毒性影响。
二、大肠杆菌内毒素对Vero细胞培养的作用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌内毒素对Vero细胞培养的作用研究（论文提纲范文）
（1）PEDV感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱及miRNA影响PEDV复制的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 猪流行性腹泻(PED)概述 |
| 1.1.1 PEDV的病原学特点及理化性质 |
| 1.1.2 PEDV基因的结构和功能 |
| 1.1.3 PED流行病学特征 |
| 1.1.4 PED流行情况 |
| 1.1.5 PED临床症状和病理变化 |
| 1.1.6 PED的致病机理 |
| 1.1.7 PED的诊断、防控和治疗 |
| 1.2 miRNA概述 |
| 1.2.1 miRNA的生物合成 |
| 1.2.2 miRNA介导的mRNA降解过程 |
| 1.2.3 miRNA对病毒复制的影响 |
| 1.3 内质网应激概述 |
| 1.3.1 内质网应激分子机制 |
| 1.3.2 内质网应激与病毒复制 |
| 1.3.3 内质网应激与miRNA |
| 1.4 细胞自噬概述 |
| 1.4.1 细胞自噬的种类 |
| 1.4.2 细胞自噬的分子机制 |
| 1.4.3 细胞自噬与病毒复制 |
| 1.4.4 细胞自噬与miRNA |
| 1.5 立题依据 |
| 第二章 PEDV变异毒株体外感染细胞模型的筛选 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 细胞、毒株和抗体 |
| 2.2.2 主要实验试剂及试剂盒 |
| 2.2.3 主要培养基及溶液的配制 |
| 2.2.4 主要仪器设备 |
| 2.2.5 PEDV的增殖实验 |
| 2.2.6 病毒滴度(TCID_(50))的测定 |
| 2.2.7 病毒RNA的提取 |
| 2.2.8 PEDV M基因标准质粒的构建和重组质粒无内毒素提取 |
| 2.2.9 质粒转染 |
| 2.2.10 PEDV实时绝对荧光定量RT-PCR |
| 2.2.11 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.2.12 Western Blot试验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PEDV YN15毒株在不同细胞系上的增殖 |
| 2.3.2 PEDV YN15毒株感染的IFA鉴定 |
| 2.3.3 PEDV YN15毒株N蛋白在不同细胞系表达的Western Blot验证 |
| 2.3.4 PEDV YN144毒株感染ST细胞 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PEDV变异强弱毒株感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱分析 |
| 3.1 研究目的及意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 毒株、细胞和抗体 |
| 3.2.2 主要试剂和试剂盒 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 |
| 3.2.4 PEDV变异强弱毒株的增殖实验 |
| 3.2.5 病毒滴度(TCID_(50))的测定 |
| 3.2.6 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 3.2.7 高通量测序样品的制备和细胞总RNA的提取 |
| 3.2.8 转录组和small RNA文库构建及高通量测序 |
| 3.2.9 高通量测序数据质量评估 |
| 3.2.10 测序序列与参考序列的比对 |
| 3.2.11 已知miRNA的校对和新miRNA的预测 |
| 3.2.12 RNA的表达水平分析 |
| 3.2.13 RNA的差异表达分析 |
| 3.2.14 GO和KEGG富集分析 |
| 3.2.15 mRNA的提取及实时相对荧光定量RT-PCR |
| 3.2.16 miRNA的提取及实时相对茎环荧光定量RT-PCR |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 PEDV变异强弱毒株在ST细胞中的复制 |
| 3.3.2 RNA样品的制备和质检 |
| 3.3.3 转录组测序及生物信息学分析 |
| 3.3.4 转录组测序结果验证 |
| 3.3.5 Small RNA测序及生物信息学分析 |
| 3.3.6 显着性差异表达miRNA的靶基因预测及富集分析 |
| 3.3.7 Small RNA测序结果验证 |
| 3.3.8 DE miRNA和靶DE mRNA联合分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 PEDV变异强弱毒株的免疫差异 |
| 3.4.2 PEDV变异强弱毒株的致病性差异 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 miR-155-5p对PEDVYN15毒株复制的影响 |
| 4.1 研究目的与意义 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞、毒株、菌株与抗体 |
| 4.2.2 载体和miRNA |
| 4.2.3 主要试剂及溶液配制 |
| 4.2.4 主要仪器设备 |
| 4.2.5 PEDV增殖实验 |
| 4.2.6 病毒滴度(TCID_(50))的测定 |
| 4.2.7 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 4.2.8 细胞活力测定(MTT) |
| 4.2.9 双荧光素酶报告基因载体构建 |
| 4.2.10 重组质粒无内毒素提取 |
| 4.2.11 miRNA和质粒转染 |
| 4.2.12 双荧光素酶报告基因系统验证靶基因 |
| 4.2.13 Western Blot试验 |
| 4.2.14 细胞总RNA的提取和相对荧光定量RT-PCR |
| 4.2.15 病毒RNA的提取和实时相对荧光定量RT-PCR |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 YN15 毒株感染影响ST细胞miR-155-5p的表达 |
| 4.3.2 miR-155-5p对YN15毒株复制的影响 |
| 4.3.3 miR-155-5p靶向结合PEDV NSP2基因 |
| 4.3.4 miR-155-5p靶向结合ST细胞的eIF2α基因 |
| 4.3.5 miR-155-5p靶向eIF2α基因影响内质网应激、细胞自噬和免疫 |
| 4.3.6 eIF2α对PEDV复制的影响 |
| 4.3.7 eIF2α磷酸化对细胞自噬和宿主免疫的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 miR-128对PEDV YN15毒株复制的影响 |
| 5.1 研究目的与意义 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞、毒株、菌株与抗体 |
| 5.2.2 载体、miRNA及siRNA |
| 5.2.3 主要试剂及溶液配制 |
| 5.2.4 主要仪器设备 |
| 5.2.5 PEDV增殖实验 |
| 5.2.6 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 5.2.7 双荧光素酶报告基因载体和CBLB过表达质粒的构建 |
| 5.2.8 重组质粒无内毒素提取 |
| 5.2.9 miRNA、siRNA与质粒转染 |
| 5.2.10 双荧光素酶报告基因系统验证靶基因 |
| 5.2.11 Western Blot试验 |
| 5.2.12 细胞总RNA的提取和相对荧光定量RT-PCR |
| 5.2.13 病毒RNA的提取和实时相对荧光定量RT-PCR |
| 5.2.14 统计学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 YN15毒株感染影响ST细胞中miR-128的表达 |
| 5.3.2 miR-128影响PEDV复制 |
| 5.3.3 miR-128靶向结合PEDV NSP13基因 |
| 5.3.4 miR-128影响细胞自噬和宿主免疫反应 |
| 5.3.5 miR-128靶向免疫因子CBLB影响PEDV复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者信息 |
| 致谢 |
（2）弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 弓形虫概述 |
| 1.1.1 弓形虫与弓形虫病 |
| 1.1.2 弓形虫的生活史 |
| 1.1.3 弓形虫的基因型和毒力 |
| 1.2 弓形虫入侵宿主细胞的机制 |
| 1.3 宿主对弓形虫的识别及免疫应答作用 |
| 1.4 弓形虫的主要毒力因子及逃逸机制 |
| 1.5 弓形虫的氧化还原系统及研究进展 |
| 1.6 CRISPR/Cas9基因敲除技术在弓形虫研究领域的应用 |
| 1.6.1 CRISPR/Cas9 的工作原理 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas9 基因敲除技术在弓形虫上的研究进展 |
| 1.6.3 基于CRISPR/Cas9 系统高通量筛选技术 |
| 1.7 选题的目的意义 |
| 第二章 氧化应激模型的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验试剂与耗材 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 Vero细胞的复苏及培养 |
| 2.1.4 弓形虫的培养 |
| 2.1.5 CCK-8 测定Vero细胞的活力 |
| 2.1.6 细胞内ROS水平的测定 |
| 2.1.7 H_2O_2对弓形虫的影响 |
| 2.1.8 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 2.1.9 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 H_2O_2对Vero细胞形态的影响 |
| 2.2.2 H_2O_2对Vero细胞活力的影响 |
| 2.2.3 H_2O_2对细胞内ROS水平的影响 |
| 2.2.4 体外孵育时间对弓形虫活力的影响 |
| 2.2.5 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 RH/CAS9 株的构建及敲除效率的验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验试剂与耗材 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 质粒pCas9-CAT和 pCas9-decoy的扩大培养及提取 |
| 3.1.5 RH/Cas9 虫株的构建 |
| 3.1.6 RH/Cas9 虫株的PCR鉴定 |
| 3.1.7 pU6-sgSAG1-DHFR质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.8 SAG1 缺失株的构建 |
| 3.1.9 RH/Cas9 株敲除效率的PCR鉴定 |
| 3.1.10 间接免疫荧光鉴定RH/Cas9 株敲除效率 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RH/Cas9 虫株的PCR鉴定 |
| 3.2.2 pU6-sgSAG1-DHFR质粒的构建 |
| 3.2.3 pU6-SAG1-DHFR质粒的鉴定 |
| 3.2.4 RH/Cas9 虫株敲除效率的验证 |
| 3.2.5 间接免疫荧光验证RH/Cas9 虫株的敲除效率 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 抗氧化相关基因的筛选及鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验试剂与耗材 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 Vero细胞的准备 |
| 4.1.4 质粒文库的准备 |
| 4.1.5 RH/Cas9 虫株的准备 |
| 4.1.6 弓形虫基因缺失株库的构建 |
| 4.1.7 H_2O_2筛选弓形虫抗氧化相关基因 |
| 4.1.8 全基因组sg RNAs的 Illumina测序 |
| 4.1.9 测序数据分析 |
| 4.1.10 构建pU6-sgHPs-DHFR质粒 |
| 4.1.11 pU6-sgRNA-DHFR质粒的扩增及提取 |
| 4.1.12 HPs单克隆缺失株的筛选 |
| 4.1.13 基因敲除虫株的PCR鉴定 |
| 4.1.14 不同缺失株对H_2O_2的敏感性试验 |
| 4.1.15 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 4.1.16 虫体活性氧检测 |
| 4.1.17 虫体MDA水平检测 |
| 4.1.18 虫体总抗氧化能力检测 |
| 4.1.19 入侵试验 |
| 4.1.20 增殖试验 |
| 4.1.21 噬斑试验 |
| 4.1.22 对小鼠的毒力试验 |
| 4.1.23 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 sgRNA文库质粒的转化及扩大 |
| 4.2.2 利用H_2O_2进行全基因组筛选 |
| 4.2.3 抗氧化基因的筛选 |
| 4.2.4 pU6-sgRNA-DHFR质粒构建 |
| 4.2.5 单基因缺失株的构建 |
| 4.2.6 不同缺失株对H_2O_2的敏感性试验 |
| 4.2.7 H_2O_2对弓形虫增殖能力的影响 |
| 4.2.8 虫体内ROS、T-AOC和 MDA水平的测定 |
| 4.2.9 弓形虫感染巨噬细胞后对巨噬细胞ROS的影响 |
| 4.2.10 HPs-KO株的入侵和增殖能力 |
| 4.2.11 噬斑试验 |
| 4.2.12 对小鼠的毒力试验 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 HP1 的表达、鉴定及与相关的虫体蛋白的筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验试剂与耗材 |
| 5.1.2 试验仪器 |
| 5.1.3 HP1 的生物信息学分析 |
| 5.1.3.1 HP1 序列分析 |
| 5.1.3.2 蛋白理化性质分析 |
| 5.1.3.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 5.1.3.4 结构域及基序分析 |
| 5.1.3.5 同源分析 |
| 5.1.4 HP1 的原核表达 |
| 5.1.4.1 虫体收集及RNA的提取 |
| 5.1.4.2 HP1 基因克隆 |
| 5.1.4.3 原核表达载体pET-32a-HP1 的构建及验证 |
| 5.1.4.4 重组蛋白HP1 的诱导表达及鉴定 |
| 5.1.4.5 重组蛋白HP1 的大量表达及纯化 |
| 5.1.5 多克隆抗体的制备 |
| 5.1.6 HP1 的定位分析 |
| 5.1.7 HP1 蛋白酶活性的测定 |
| 5.1.8 免疫共沉淀 |
| 5.1.8.1 虫体蛋白的准备 |
| 5.1.8.2 去除非特异性结合 |
| 5.1.8.3 免疫共沉淀 |
| 5.1.8.4 质谱分析 |
| 5.1.8.5 数据库检索 |
| 5.1.8.6 生物信息学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 生物信息学分析 |
| 5.2.1.1 HP1 基因结构 |
| 5.2.1.2 蛋白理化性质分析 |
| 5.2.1.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 5.2.1.4 结构域及基序分析 |
| 5.2.1.5 多物种氨基酸序列比对及同源进化分析 |
| 5.2.2 HP1 的表达及鉴定 |
| 5.2.2.1 HP1 的扩增 |
| 5.2.2.2 重组质粒pET-32a-HP1 的鉴定 |
| 5.2.3 HP1 重组蛋白的表达及纯化 |
| 5.2.4 HP1 的定位分析 |
| 5.2.5 HP1 蛋白酶活性测定 |
| 5.2.6 与相互作用蛋白的筛选及鉴定 |
| 5.2.6.1 SDS-PAGE鉴定免疫产物 |
| 5.2.6.2 质谱分析及数据库检索结果 |
| 5.2.6.3 质谱数据分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 弓形虫HP1-KO株的构建及转录组分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验试剂与耗材 |
| 6.1.2 试验仪器 |
| 6.1.3 CRISPR/Cas9 基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及鉴定 |
| 6.1.4 HP1 缺失株的构建 |
| 6.1.5 HP1 缺失株的PCR验证 |
| 6.1.6 HP1 互补株的构建 |
| 6.1.7 弓形虫HP1-KO虫株的转录组分析 |
| 6.1.7.1 样品收集 |
| 6.1.7.2 RNA提取 |
| 6.1.7.3 转录组测序及序列比对分析 |
| 6.1.7.4 差异基因的GO分析及KEGG富集分析 |
| 6.1.8 荧光定量PCR验证差异基因 |
| 6.1.9 数据分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 HP1 敲除质粒的构建与鉴定 |
| 6.2.2 HP1 缺失株的PCR鉴定 |
| 6.2.3 HP1 互补株的构建 |
| 6.2.4 弓形虫HP1-KO虫株的转录组分析 |
| 6.2.4.1 数据质控 |
| 6.2.4.2 样本关系分析 |
| 6.2.4.3 差异基因分析 |
| 6.2.4.4 GO分析 |
| 6.2.4.5 KEGG分析 |
| 6.2.5 荧光定量PCR验证差异基因 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 HP1 与CAT的双基因缺失株的构建及表型研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验试剂与耗材 |
| 7.1.2 试验仪器 |
| 7.1.3 CAT基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及鉴定 |
| 7.1.4 HP1 与CAT双基因缺失株的构建及验证 |
| 7.1.5 H_2O_2对HP1/CAT双缺失株的影响 |
| 7.1.6 小鼠体内增殖试验 |
| 7.1.7 对小鼠的毒力试验 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 HP1 与CAT双基因缺失株的构建及验证 |
| 7.2.2 HP1/CAT-KO对 H_2O_2的敏感性试验 |
| 7.2.3 小鼠体内试验 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 AKHP的原核表达、敲除及功能研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试验试剂与耗材 |
| 8.1.2 试验仪器 |
| 8.1.3 AKHP的生物学信息分析 |
| 8.1.4 AKHP的原核表达 |
| 8.1.5 WB验证 |
| 8.1.6 AKHP定位分析 |
| 8.1.6.1 定位质粒pMD-18T-AKHP的构建 |
| 8.1.6.2 定位分析 |
| 8.1.7 CRISPR/Cas9 基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及AKHP缺失株的构建 |
| 8.1.8 互补株的构建 |
| 8.1.9 间接免疫荧光分析 |
| 8.1.10 AKHP缺失株的表型分析 |
| 8.1.10.1 入侵试验 |
| 8.1.10.2 增殖试验 |
| 8.1.11 AKHP缺失株株对H_2O_2的敏感性 |
| 8.1.12 抗氧化能力测定 |
| 8.1.13 AKHP的缺失对其他抗氧化基因的影响 |
| 8.1.14 AKHP缺失株对巨噬细胞ROS的影响 |
| 8.1.15 数据分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 生物信息学分析 |
| 8.2.1.1 AKHP的基因结构 |
| 8.2.1.2 AKHP理化性质分析 |
| 8.2.1.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 8.2.1.4 AKHP氨基酸序列对比 |
| 8.2.1.5 三级结构预测 |
| 8.2.1.6 蛋白互作关系分析 |
| 8.2.2 AKHP蛋白表达 |
| 8.2.2.1 AKHP的编码全长扩增 |
| 8.2.2.2 重组质粒pET-28a-AKHP的鉴定 |
| 8.2.2.3 AKHP重组蛋白的表达及纯化 |
| 8.2.3 AKHP的 WB验证 |
| 8.2.4 AKHP的定位分析 |
| 8.2.5 AKHP敲除质粒的构建及鉴定 |
| 8.2.6 AKHP缺失株的PCR鉴定 |
| 8.2.7 AKHP互补株的PCR鉴定 |
| 8.2.8 AKHP缺失株的间接免疫荧光鉴定 |
| 8.2.9 表型分析 |
| 8.2.10 AKHP缺失株对H_2O_2敏感性试验 |
| 8.2.11 抗氧化指标的测定 |
| 8.2.12 AKHP基因对其他抗氧化基因表达量的影响 |
| 8.2.13 AKHP缺失对巨噬细胞ROS水平的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）硫化氢对内毒素导致成骨细胞凋亡影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:对革兰阴性菌在体外及体内释放硫化氢能力的研究 |
| l 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂及器材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 革兰阴性菌培养及细菌悬液制备 |
| 2.2.2 革兰阴性菌体外释放硫化氢的检测 |
| 2.2.3 实验动物的饲养 |
| 2.2.4 实验动物的分组及骨髓炎模型制备方法 |
| 2.2.5 实验动物样品的采集 |
| 2.2.6 组织样品中硫化氢的测定 |
| 2.2.7 组织样品病理学观察 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 革兰阴性菌在体外可以释放硫化氢 |
| 3.2 革兰阴性菌在体内引发慢性骨髓炎 |
| 3.3 革兰阴性菌在体内可以释放硫化氢 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:硫化氢对内毒素诱导的成骨细胞凋亡及成骨分化能力的影响 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 主要试剂及器材 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞复苏 |
| 6.2.2 细胞换液和细胞传代 |
| 6.2.3 细胞冷冻保存 |
| 6.2.4 细胞计数 |
| 6.2.5 MTT细胞活性检测 |
| 6.2.6 细胞的形态学观察 |
| 6.2.7 Hoechst33342/DAPI细胞染色 |
| 6.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 6.2.9 细胞成骨诱导分化 |
| 6.2.10 Western blot检测 |
| 6.2.11 碱性磷酸酶试剂盒检测成骨能力 |
| 6.2.12 实时定量PCR检测 |
| 6.2.14 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 硫化氢及内毒素对成骨细胞增殖情况的影响 |
| 7.2 硫化氢及内毒素对成骨细胞凋亡情况的影响 |
| 7.2.1 硫化氢加重内毒素介导的成骨细胞凋亡 |
| 7.2.2 硫化氢对内毒素介导成骨细胞凋亡相关蛋白表达影响 |
| 7.2.3 FAS特异性抑制剂减轻硫化氢对内毒素凋亡的促进作用 |
| 7.3 硫化氢及内毒素对成骨细胞成骨情况的影响 |
| 8 讨论 |
| 第三部分:硫化氢影响内毒素诱导的成骨细胞凋亡及成骨分化能力的作用机制 |
| 9 前言 |
| 10 材料与方法 |
| 10.1 主要试剂和仪器 |
| 10.1.1 主要试剂及器材 |
| 10.1.2 主要仪器 |
| 10.2 实验方法 |
| 10.2.1 Western blot检测AKT/NF-κB通路表达情况 |
| 10.2.2 免疫荧光染色检测AKT/NF-κB通路表达情况 |
| 10.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 10.2.4 qPCR对 COX-2 及成骨分化相关基因表达进行检测 |
| 10.2.5 茜素红染色 |
| 10.2.6 碱性磷酸酶试剂盒检测成骨能力 |
| 10.2.7 统计学分析 |
| 11 实验结果 |
| 11.1 硫化氢通过抑制AKT/NF-κB通路表达来促进凋亡 |
| 11.2 激活AKT通路可以改善成骨细胞凋亡 |
| 11.3 激活AKT通路可以促进成骨细胞成骨能力 |
| 11.4 硫化氢抑制COX-2表达 |
| 12 讨论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）抗PEDV复制ISG分子的筛选及OASL抗病毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 猪流行性腹泻病毒的研究进展 |
| 1 猪流行性腹泻病毒基本特征与蛋白功能 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒基本特征 |
| 1.2 猪流行性腹泻病毒蛋白功能 |
| 2 猪流行性腹泻流行病学研究进展 |
| 3 猪流行性腹泻病毒的诊断与预防 |
| 3.1 PEDV诊断方法 |
| 3.2 PEDV疫苗 |
| 4 天然免疫在抗病毒反应过程中的作用 |
| 4.1 干扰素信号通路 |
| 4.2 干扰素刺激因子(ISGs) |
| 5 PEDV感染与天然免疫应答的关系 |
| 5.1 PEDV拮抗宿主细胞内Ⅰ型干扰素的产生 |
| 5.2 宿主细胞LncRNA对病毒感染的调控作用 |
| 下篇 试验部分 |
| 第二章 基于转录组分析筛选抗PEDV复制的ISGs |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞,毒株与载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细胞复苏、培养、传代与冻存 |
| 2.2 PEDV 85-7亲本株和C40细胞传代株的生长曲线及生长特性测定 |
| 2.3 检测PEDV 85-7亲本株和C40株细胞内复制水平 |
| 2.4 比较PEDV 85-7株和C40株感染MARC-145时吸附阶段差异 |
| 2.5 比较PEDV 85-7株和C40株感染MARC-145时入胞阶段差异 |
| 2.6 转录组比较分析PEDV 85-7亲本株和C40株与荧光定量PCR验证 |
| 2.7 重组ISGs真核表达质粒的构建与提取 |
| 2.8 重组ISGs真核表达质粒的细胞转染 |
| 2.9 检测ISGs蛋白的表达 |
| 2.10 筛选具有抗PEDV病毒复制作用的ISGs |
| 2.11 鉴定ISGs是否影响病毒吸附和入胞 |
| 2.12 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV 85-7亲本株和C40株的生长曲线及生长特性测定 |
| 3.2 PEDV 85-7亲本株和C40株吸附和入胞差异 |
| 3.3 PEDV 85-7亲本株和C40株的转录组比较分析与荧光定量PCR验证 |
| 3.4 重组ISGs真核表达质粒的构建与提取 |
| 3.5 重组ISGs真核表达质粒的转染与蛋白表达鉴定 |
| 3.6 筛选具有抗PEDV病毒复制能力的ISGs |
| 3.7 测定6种ISGs对病毒的吸附和入胞阶段的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 OASL蛋白抑制PEDV复制的机制初步研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞,毒株与载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 PEDV感染激活OASL内源性表达规律 |
| 2.2 OASL过表达对PEDV增殖的影响 |
| 2.3 OASL瞬时沉默对PEDV增殖的影响 |
| 2.4 OAS/RNase L通路对OASL抗病毒作用的影响 |
| 2.5 干扰素通路对OASL的影响 |
| 2.6 OASL对RIG-1或MDA5介导的干扰素途径的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV感染激活OASL内源性表达规律 |
| 3.2 OASL过表达对PEDV增殖的影响 |
| 3.3 OASL瞬时沉默对PEDV增殖的影响 |
| 3.4 OASL不依赖于OAS/RNase L通路发挥抗病毒作用 |
| 3.5 OASL依赖并调控干扰素通路 |
| 3.6 OASL通过激活RIG-1或MDA5影响干扰素途径 |
| 4 讨论 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒中和位点原核表达及抗体制备 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞,毒株与载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病料采集与处理 |
| 2.2 病毒基因组提取与测序 |
| 2.3 构建PEDV原核表达质粒 |
| 2.4 蛋白纯化及抗体制备 |
| 2.5 验证不同多抗的免疫效果 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV病料检测和PEDV-S基因测序 |
| 3.2 PEDV截短S序列比对 |
| 3.3 PEDV原核表达质粒构建 |
| 3.4 重组蛋白诱导表达与纯化 |
| 3.5 抗体制备与效价检测 |
| 3.6 抗体SDS-PAGE与Western blotting分析 |
| 3.7 验证不同多抗的免疫性效果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（5）巴氏杆菌toxA基因的原核表达及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1实验动物 |
| 1.2主要试剂 |
| 1.3菌株的分离与鉴定 |
| 1.4重组质粒的构建 |
| 1.5重组质粒的原核表达、可溶性鉴定及Westernblot检测 |
| 1.6目的蛋白的纯化及内毒素的去除 |
| 1.7 r PMT生物学活性的检测 |
| 1.7.1体外细胞毒性试验 |
| 1.7.2豚鼠皮肤坏死试验 |
| 1.8多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2结果 |
| 2.1巴氏杆菌的鉴定 |
| 2.2重组质粒的双酶切鉴定 |
| 2.3重组蛋白的表达、纯化、鉴定及内毒素检测 |
| 2.4体外细胞毒性试验 |
| 2.5豚鼠皮肤坏死试验 |
| 2.6多克隆抗体的鉴定 |
| 3讨论 |
（6）豫南地区鸡大肠杆菌病病原学调查与防控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 鸡大肠杆菌病研究进展 |
| 1 研究背景 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 鸡大肠杆菌病病原学 |
| 2.2 大肠杆菌耐药性 |
| 2.3 中药抑菌作用及机制 |
| 2.4 鸡大肠杆菌疫苗 |
| 2.5 鸡大肠杆菌病防治 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 豫南地区鸡大肠杆菌发病状况分析 |
| 3.2 分离菌株药物敏感性测定 |
| 3.3 中药活性成分联合抗菌药物增效作用研究 |
| 3.4 鸡大肠杆菌分离菌株致病性和免疫原性分析 |
| 3.5 鸡大肠杆菌氢氧化铝多价灭活苗研究 |
| 第二章 豫南地区鸡致病性大肠杆菌分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细菌分离 |
| 2.2 分离培养 |
| 2.3 生化鉴定 |
| 2.4 PCR鉴定 |
| 2.5 血清型鉴定 |
| 2.6 致病性试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 鸡致病性大肠杆菌对常用抗菌药物耐药性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细菌的最佳生长时期 |
| 2.2 β-内酰胺类药物体外抑菌活性 |
| 2.3 氨基糖苷类药物体外抑菌活性 |
| 2.4 酚胺醇类药物体外抑菌活性 |
| 2.5 喹诺酮类药物体外抑菌活性 |
| 2.6 其他药物体外抑菌活性 |
| 2.7 鸡大肠杆菌耐药谱分析 |
| 2.8 大肠杆菌中I型整合酶基因扩增 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 中药活性成分与氨基糖苷类药物体外联合抗菌作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 穿心莲内酯联合抗菌药物体外联合抑菌活性 |
| 2.2 黄芩苷联合抗菌药物体外联合抑菌活性 |
| 2.3 小檗碱联合抗菌药物体外联合抑菌活性 |
| 2.4 蒲公英提取物联合抗菌药物体外联合抑菌活性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 鸡大肠杆菌多价灭活苗优势菌株筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 毒力试验 |
| 2.2 免疫原性试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 鸡大肠杆菌多价灭活苗制备与评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 无菌检验 |
| 2.2 安全检验 |
| 2.3 效力检验 |
| 2.4 免疫持续期试验 |
| 2.5 免疫反应 |
| 2.6 免疫效果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读博士学位期间研究成果 |
（7）HMGB1在猪流行性腹泻病毒感染中作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪流行性腹泻病毒的研究进展 |
| 1 病毒的基本特征 |
| 2 非结构蛋白和功能 |
| 2.1 非结构蛋白Nsp1 |
| 2.2 非结构蛋白Nsp2 |
| 2.3 非结构蛋白Nsp3 |
| 2.4 非结构蛋白Nsp4,Nsp5和Nsp6 |
| 2.5 非结构蛋白Nsp7, Nsp8, Nsp9, Nsp10和Nsp11 |
| 2.6 非结构蛋白Nsp12, Nsp13, Nsp14, Nsp15和Nsp16 |
| 2.7 ORF3 |
| 3 结构蛋白的结构和功能 |
| 3.1 纤突蛋白spike(S蛋白) |
| 3.2 糖基化膜蛋白(M蛋白) |
| 3.3 小包膜糖蛋白(E蛋白) |
| 3.4 核衣壳蛋白(Nprotein) |
| 4 PED流行病学研究进展 |
| 4.1 国外流行情况 |
| 4.2 国内流行情况 |
| 5 PED的诊断 |
| 5.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 5.2 分子生物学检测 |
| 6 PED的预防及治疗 |
| 参考文献 |
| 第二章 PEDV吸附受体和HMGB1的相关研究进展 |
| 1 PEDV吸附受体的研究 |
| 2 HMGB1的研究进展 |
| 2.1 高迁移率族蛋白家族 |
| 2.2 HMGB1的结构和功能 |
| 2.3 HMGB1的释放 |
| 2.4 HMGB1的受体与信号转导 |
| 2.5 HMGB1的氧化还原 |
| 2.6 HMGB1在病毒性疾病中的作用 |
| 2.7 HMGB1的抑制剂 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究部分 |
| 第三章 甘草素对PEDV的抗病毒效果 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 常用溶液 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细胞的复苏、培养、传代和冻存 |
| 2.2 病毒的培养 |
| 2.3 病毒滴度的测定 |
| 2.4 Western blot分析 |
| 2.5 荧光定量PCR |
| 2.6 甘草素对Vero细胞毒性的测定 |
| 2.7 western blot试验分析甘草素对PEDV感染的影响 |
| 2.8 荧光定量PCR分析甘草素(GLY)对PEDV感染的影响 |
| 2.9 噬斑形成试验分析甘草素(GLY)对PEDV感染的影响 |
| 2.10 甘草素(GLY)对PEDV入胞和复制的影响 |
| 2.11 甘草素对PEDV组装和释放的影响 |
| 2.12 甘草素对病毒粒子的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 甘草素对Vero细胞毒性的影响 |
| 3.2 甘草素对PEDV的抗病毒效果 |
| 3.3 甘草素对PEDV入胞和复制的影响 |
| 3.4 甘草素对PEDV组装和释放的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 HMGB1在甘草素的抗病毒过程中起着重要的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 甘草素降低PEDV诱导的促炎性因子的增加 |
| 3.2 Poly (I:C)对PEDV的影响 |
| 3.3 HMGB1在PEDV感染中有重要的作用 |
| 3.4 甘草素通过HMGB1/TLR4抑制PEDV感染 |
| 3.5 甘草素通过HMGB1/RAGE抑制PEDV感染 |
| 3.6 HMGB1通过P38MAPK引起促炎症因子的升高 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 硫酸类肝素是猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞的吸附因子 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 GAGs在PEDV感染中的作用 |
| 2.2 肝素酶Ⅰ对PEDV吸附的影响 |
| 2.3 氯酸钠处理细胞 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 肝素对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero细胞的影响 |
| 3.2 肝素酶Ⅰ对PEDV感染Vero细胞的影响 |
| 3.3 氯酸钠对PEDV感染Vero细胞的影响 |
| 3.4 N-乙酰化O-硫酸化肝素(de-O)对PEDV的影响 |
| 3.5 N-去硫酸化肝素(de-N)对PEDV的影响 |
| 3.6 肝素对PEDV复制的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 PEDV N蛋白通过与C/EBP-β相互作用来正调HMGB1的转录及乙酰化和释放 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒 |
| 1.2 试剂与抗体 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 HMGB1启动子质粒的构建 |
| 2.2 HMGB1启动子上转录因子的突变与转染 |
| 2.3 激光共聚焦 |
| 2.4 染色体免疫共沉淀(CHIP) |
| 2.5 报告基因试验 |
| 2.6 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.7 核质分离 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV感染诱导乙酰化HMGB1释放 |
| 3.2 乙酰化的HMGB1对于PEDV诱导的HMGB1释放是必需的 |
| 3.3 PEDV-N促进HMGB1的释放 |
| 3.4 PEDV-N在HMGB1启动子区富集,且C/EBP负责HMGB1的转录 |
| 3.5 PEDV-N与C/EBPβ相互作用 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 猪流行性腹泻病毒通过DNA损伤引起HMGB1的释放 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与病毒 |
| 1.2 主要试剂和抗体 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 流式细胞术测定胞内ROS的变化 |
| 2.2 间接免疫荧光 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪流行性腹泻病毒引起DNA损伤 |
| 3.2 NU7441 or KU-55933抑制PEDV的感染 |
| 3.3 PEDV引起了PARP1激活 |
| 3.4 PEDV引起了Vero细胞产生ROS |
| 3.5 DNA损伤引起PARP1的激活 |
| 3.6 ROS是PARP1和DNA损伤的下游分子 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体RL1序列抗凋亡作用的研究及其编码的microRNA的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 单纯疱疹病毒Ⅱ型简述 |
| 1.2 HSV 的形态与结构 |
| 1.3 HSV-2 基因组结构和基因表达 |
| 1.3.1 HSV-2 基因组结构 |
| 1.3.2 HSV-2 的基因表达 |
| 1.4 单纯疱疹病毒的 LAT 基因 |
| 1.4.1 LAT 家族 |
| 1.4.2 LAT 的开放读码框（ORF） |
| 1.4.3 LAT 的启动子 |
| 1.5 LAT 基因的作用机制 |
| 1.5.1 LAT 下调单纯疱疹病毒裂解基因的表达 |
| 1.5.2 LAT 的抗凋亡作用 |
| 1.5.3 LAT 抗凋亡作用的区域 |
| 1.5.4 LAT 抗凋亡作用的机制 |
| 1.5.4.1 LAT 通过编码蛋白质介导抗凋亡功能 |
| 1.5.4.2 潜伏相关转录体（LAT）通过编码 microRNA 执行抗凋亡功能 |
| 1.6 本课题主要内容及意义 |
| 1.6.1 本课题的研究意义 |
| 1.6.2 本课题的研究内容 |
| 第二章 单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT RL1 真核表达载体的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 主要实验材料 |
| 2.2.1 实验耗材和仪器 |
| 2.2.2 细胞、病毒株、菌株和质粒 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 溶液和培养基 |
| 2.3 技术路线 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 复苏非洲绿猴肾细胞 |
| 2.4.2 传代非洲绿猴肾细胞 |
| 2.4.3 冻存非洲绿猴肾细胞 |
| 2.4.4 单纯疱疹病毒Ⅱ型培养 |
| 2.4.5 提取单纯疱疹病毒基因组 DNA |
| 2.4.6 PCR 扩增单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT 基因 RL1 序列的 |
| 2.4.7 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物 |
| 2.4.8 凝胶回收纯化 PCR 产物 |
| 2.4.9 pEGFP-C2 真核表达质粒的扩增 |
| 2.4.9.1 大肠杆菌细胞感受态的制备 |
| 2.4.9.2 质粒 pEGFP-C2 转化 |
| 2.4.9.3 提取 pEGFP-C2 质粒 |
| 2.4.10 pEGFP-C2 空载体和单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2） LAT-RL1 序列的双酶切 |
| 2.4.11 双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳验证 |
| 2.4.12 回收纯化双酶切的产物 |
| 2.4.13 单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）潜伏相关转录体（LAT）RL1 序列和大肠杆菌质粒pEGFP-C2 连接 |
| 2.4.14 大肠杆菌 Top10 感受态细胞制备 |
| 2.4.15 连接产物的转化 |
| 2.4.16 阳性菌落 PCR 的初步鉴定 |
| 2.4.17 重组的真核表达载体大肠杆菌质粒 pEGFP-RL1 的提取 |
| 2.4.18 重组的真核表达载体大肠杆菌质粒 pEGFP-RL1 单双酶切鉴定 |
| 2.4.19 双酶切目的产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.4.20 重组真核表达载体 pEGFP-RL1 上 RL1 序列的测序鉴定 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 Vero 细胞 CPE 病变 |
| 2.5.2 HSV-2 LAT 基因 RL1 序列的 PCR 扩增 |
| 2.5.3 阳性菌落的 PCR 鉴定 |
| 2.5.4 重组真核表达载体 pEGFP-C2/LAT RL1 的酶切和测序鉴定 |
| 2.5.5 重组真核表达载体 pEGFP-RL1 的测序鉴定 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 单纯疱疹病毒Ⅱ型 LAT 基因 RL1 在真核细胞中的表达及鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 主要实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器和耗材 |
| 3.2.2 细胞、菌株和质粒 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 溶液 |
| 3.3 技术路线 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 小提无内毒素质粒 |
| 3.4.2 质粒浓度的测定 |
| 3.4.3 Vero 细胞的培养 |
| 3.4.3.1 Vero 细胞的复苏 |
| 3.4.3.2 Vero 细胞的传代培养 |
| 3.4.3.3 Vero 细胞的冻存 |
| 3.4.4 PC12 细胞的培养 |
| 3.4.5 重组质粒转染 Vero 细胞和 PC12 细胞 |
| 3.4.6 RT-PCR 鉴定 LAT-RL1 转录 |
| 3.4.6.1 提取 Vero 和 PC12 细胞总的 RNA |
| 3.4.6.2 逆转录得到第一链 cDNA |
| 3.4.6.3 以逆转录所得的 cDNA 为模板进行 PCR |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 Vero 细胞的培养 |
| 3.5.2 PC12 细胞的培养 |
| 3.5.3 质粒在 Vero 和 PC12 细胞中的表达 |
| 3.5.4 RT-PCR 检测 LAT- RL1 在 Vero 细胞中的表达 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 单纯疱疹病毒Ⅱ型LAT-RL1片段对Vero细胞及PC12细胞的抗凋亡作用研究及 miRNA的筛选 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 主要实验材料 |
| 4.2.1 仪器和设备 |
| 4.2.2 菌株、质粒和细胞 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 溶液 |
| 4.3 技术路线 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 Vero 细胞及 PC12 细胞的的培养 |
| 4.4.2 质粒转染 Vero 和 PC12 细胞 |
| 4.4.3 G418 对筛选稳定转染的细胞 |
| 4.4.4 放线菌素 D(actinomycin D，ACTD)诱导 Vero 细胞及 PC12 细胞凋亡 |
| 4.4.5 MTT 法检测细胞增殖 |
| 4.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 4.4.7 Hoechst33342 荧光染色观察细胞凋亡 |
| 4.4.8 JC-1 细胞凋亡线粒体膜电位检测 |
| 4.4.9 DNA ladder 检测细胞凋亡 |
| 4.4.10 Caspase 3 凋亡蛋白检测 |
| 4.4.11 Vero 和 PC12 细胞总蛋白鉴定 |
| 4.4.11.1 Vero 和 PC12 细胞总蛋白的提取 |
| 4.4.11.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定、分离蛋白质 |
| 4.4.12 qRT-PCR 检测 HSV-2 LAT RL1 编码的 microRNA |
| 4.4.12.1 引物的设计和合成 |
| 4.4.12.2 总 RNA 提取 |
| 4.4.12.3 逆转录实验 |
| 4.4.12.4 荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 |
| 4.4.12.5 统计学分析实验结果 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 质粒 pEGFP-RL1 在 Vero 细胞中及 PC12 细胞中表达的荧光特点 |
| 4.5.2 放线菌素 D 诱导 Vero 细胞及 PC12 细胞凋亡模型的建立 |
| 4.5.3 电转化及 G418 细胞稳定表达筛选 |
| 4.5.4 MTT 法测重组质粒对 Vero 细胞及 PC12 细胞活性的影响 |
| 4.5.5 Hochest 33342 染色观察细胞凋亡 |
| 4.5.6 JC-1 荧光染色观察细胞凋亡 |
| 4.5.7 MTT 分析细胞增殖 |
| 4.5.8 流式细胞仪检测 |
| 4.5.9 DNA ladder 检测细胞凋亡 |
| 4.5.10 荧光分光光度计检测 Caspase3 活性 |
| 4.5.11 SDS-PAGE 检测蛋白的表达 |
| 4.5.12 qRT-PCR 检测稳定转染 pEGFP-RL1 的 Vero 细胞及 PC12 细胞中的 microRNA 表达 |
| 4.6 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 本论文的创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）猪LBP和BPI基因多态性及其蛋白质N端功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 LBP和BPI的结构与功能及其研究进展 |
| 2.1 LBP的结构与功能及其研究进展 |
| 2.2 BPI的结构与功能及其研究进展 |
| 3 LBP基因和BPI基因的遗传变异研究现状 |
| 3.1 人LBP基因和BPI基因的遗传变异研究现状 |
| 3.2 猪LBP基因和BPI基因的遗传变异研究现状 |
| 4 重组蛋白的表达方式及纯化复性 |
| 4.1 重组蛋白的表达方式 |
| 4.2 重组蛋白的回收纯化 |
| 5 本研究目的意义 |
| 第二章 BPI和LBP基因遗传变异及其与猪生长性状相关性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪DNA基因组的提取和检测 |
| 2.2 PCR扩增及电泳检测 |
| 2.3 序列分析 |
| 2.4 遗传标记的建立 |
| 2.5 群体中基因频率及基因型频率和多态杂合度 |
| 2.6 黔邵花猪基因多态与生长性状的相关分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪BPI和LBP基因cDNA克隆及蛋白质序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪总RNA的浓度和纯度 |
| 2.2 RNA及RT-PCR产物的电泳检测结果 |
| 2.3 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.4 克隆序列测定及分析 |
| 2.5 猪BPI推导氨基酸序列的基本特征 |
| 2.6 猪LBP推导氨基酸序列的基本特征 |
| 2.7 不同物种BPI及LBP的序列相似性比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 猪BPI基因的功能分析 |
| 3.2 猪LBP基因的功能分析 |
| 4 结论 |
| 第四章 猪BPIN端基因片段原核表达载体的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA电泳检测 |
| 2.2 猪BPI和LBP基因片段电泳检测 |
| 2.3 酶切与纯化电泳检测 |
| 2.4 猪BPIN端基因片段测序鉴定 |
| 2.5 重组子的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 猪BPIN端基因片段原核表达及其体外杀菌活性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪BPIN端蛋白的表达鉴定 |
| 2.2 重组猪BPIN端蛋白的体外活性检测 |
| 2.3 重组猪BPI肽的基因工程菌 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原核表达融合蛋白及其回收纯化 |
| 3.2 重组猪BPI肽的基因工程菌 |
| 3.3 重组猪BPI肽的体外活性 |
| 4 小结 |
| 第六章 猪LBPN端基因片段真核表达载体构建及表达鉴定与功能初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪LBPN端基因片段电泳检测 |
| 2.2 酶切与纯化电泳检测 |
| 2.3 猪LBPN端基因片段测序鉴定 |
| 2.4 重组子的鉴定 |
| 2.5 重组猪BPIN端基因片段真核表达质粒检测 |
| 2.6 Vero细胞的复苏和传代培养 |
| 2.7 重组质粒转染Vero细胞 |
| 2.8 重组质粒真核表达的鉴定 |
| 2.9 重组质粒真核表达的Western blot鉴定 |
| 2.10 免疫后小鼠体温差异比较 |
| 2.11 免疫后小鼠血液中免疫指标的比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 内毒素对Vero细胞生长及转染的影响 |
| 3.2 猪LBPN端基因片段真核表达质粒DNA抗炎效果的评价 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写索引 |
| 实验用主要试剂的配制 |
| 实验用到的载体图谱 |
| 部分测序波峰图 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 在读期间发表的论文及主持的科研项目 |
（10）大肠杆菌内毒素对小鼠繁殖机能及肝脏部分生化指标影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 内毒素 |
| 2 内毒素对雌性动物繁殖机能的影响 |
| 2.1 内毒素对卵泡发育及排卵的影响 |
| 2.2 内毒素与胚胎附植，发育的影响 |
| 3 作用机理 |
| 3.1 内毒素与细胞因子 |
| 3.2 雌性生殖与细胞因子 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第二章 大肠杆菌O55:B5血清型LPS对小鼠卵泡发育及排卵机能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 结果统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠对LPS的临床反应 |
| 2.2 LPS对小鼠卵泡发育的影响 |
| 2.3 LPS对小鼠排卵的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 大肠杆菌O55:B5血清型LPS对昆明系小白鼠IVF及胚胎附植的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 大肠杆菌O55:B5型内毒素对小鼠体外受精及胚胎发育的影响 |
| 2.2 大肠杆菌O55:B5型内毒素对小鼠体胚胎附植的影响结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大肠杆菌O55:B5型内毒素对小鼠体外受精及胚胎发育的影响 |
| 3.2 大肠杆菌O55:B5型内毒素对小鼠体胚胎附植的影响结果 |
| 第四章 小鼠血液内毒素的定量检测及其对肝脏部分生化指标的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 雌性小鼠血液内毒素浓度定量检测 |
| 2.2 肝脏组织匀浆中AST、ALT的检测 |
| 2.3 肝脏组织匀浆中NO、SOD及MDA的检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 雌性小鼠体内内毒素降解速度定量检测 |
| 3.2 肝脏组织匀浆中AST，ALT的检测 |
| 3.3 肝脏组织匀浆中NO、SOD及MDA的检测 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、大肠杆菌内毒素对Vero细胞培养的作用研究（论文参考文献）
- [1]PEDV感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱及miRNA影响PEDV复制的机制研究[D]. 张晓茜. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究[D]. 陈芸. 中国农业科学院, 2021(01)
- [3]硫化氢对内毒素导致成骨细胞凋亡影响的研究[D]. 王汉石. 中国医科大学, 2020(01)
- [4]抗PEDV复制ISG分子的筛选及OASL抗病毒机制研究[D]. 余迮艳秋. 南京农业大学, 2019(08)
- [5]巴氏杆菌toxA基因的原核表达及生物学特性研究[J]. 张健淞,夏雨婷,沈懿娟,梁中洋,李玉峰. 中国兽医科学, 2018(08)
- [6]豫南地区鸡大肠杆菌病病原学调查与防控研究[D]. 黄立. 南京农业大学, 2017(07)
- [7]HMGB1在猪流行性腹泻病毒感染中作用机制的研究[D]. 郇长超. 南京农业大学, 2016(12)
- [8]单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体RL1序列抗凋亡作用的研究及其编码的microRNA的筛选[D]. 钟菲菲. 华南理工大学, 2014(01)
- [9]猪LBP和BPI基因多态性及其蛋白质N端功能研究[D]. 魏麟. 湖南农业大学, 2011(01)
- [10]大肠杆菌内毒素对小鼠繁殖机能及肝脏部分生化指标影响[D]. 潘文武. 湖南农业大学, 2009(S1)